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  4. CAR-T 세포 치료 가속화

인체의 면역체계를 이용해 종양 세포를 죽이는 면역세포 요법은 다양한 암을 치료하는 획기적인 전략이 될 것으로 전망된다. 그 중 키메라 항원 수용체 t 세포 면역 요법(CAR-T)은 다양한 혈액 시스템의 악성 종양 치료에 상당한 효과를 얻었습니다. 2022년 기준 전 세계적으로 7개의 CAR-T 세포 치료 제품이 출시되었으며 그 중 3개는 중국에서 출시되었습니다.

각 CAR-T 세포 치료의 긴 여정은 반복성 기초 연구를 수행하는 안정적인 단계로 시작됩니다. 연구 과정은 일반적으로 CAR 분자 설계, 렌티 바이러스 패키징, CAR-T세포 구축, in vitro and in vivo killing assay, cytotoxicity tests 등을 포함한다. 효과적이고 안정적인 CAR-T 세포를 구성하기 위해서는 CAR 분자 구조의 합리적인 설계, T cell transfection conditions 탐색, CAR-T 세포의 식별, 순도 및 효능 확인과 같은 많은 요인을 충분히 고려해야 합니다.

Cyagen은 16년 이상의 종양 면역세포 및 동물모델 연구 경험을 보유하고 있으며, CAR-T 세포의 체내외 치료 연구를 위한 원스톱 서비스 플랫폼을 제공하고 있다. 우리의 플랫폼은 단일 가닥 항체 서열 스크리닝(scFv sequence screening), CAR 분자 설계 및 전체 프로세스 서비스를 포함하여 CAR-t 세포 치료에 대한 기초 연구를 제공하는 글로벌 연구자를 대상으로 합니다. 이러한 포괄적인 서비스는 CAR-T/NK 연구와 관련 분야의 효율성과 정확성을 단순화하는 데 도움이 됩니다.무료 문의는 86 20-31601779으로 전화하시거나 [email protected] 으로 이메일을 보내주시기 바랍니다.

CAR-T 세포 치료 연구 원스톱 서
비스 플랫폼
바이러스 벡터 제조
  • CAR design
  • Lentiviral packaging and optimization
  • CAR-T cell construction
종양 모델 구축 플랫폼
  • Target cell construction
  • C-NKG Severe Immunodeficient Mouse Model
  • CDX mouse tumor model
  • Humanized model of PBMC/HSC immune system
체외 약효 평가
  • In vitro killing function evaluation of CAR-T cells
  • Cytokine detection
  • Functional experiments such as cell proliferation/apoptosis/migration/invasion
체내 약효 평가
  • Construction of CDX C-NKG mouse and CDX PBMC/HSC C-NKG mouse models
  • Pharmacodynamic evaluation of CAR-T/TCR-T/NK/TIL cells
  • Immunohistochemistry (IHC), HE staining, lymphocyte infiltration analysis
프로젝트 유형 프로젝트 기술적 어려움 Cyagen 플랫폼의 서비스 이점
표적 세포 구축 Difficulty in selecting target cell types A wide range of tumor cells & overexpressing CHO/HEK293 cells in stock
The expression level of the target is not high enough Experience of 500+ stably transformed cell lines construction projects
CAR 벡터 디자인 및 렌티바이러스 패키징 Lack of experience in CAR molecular structure design Extensive experience in designing CAR molecules of different targets
Low virus titer and difficult purification High-quality lentiviral vector and virus packaging, published by multiple peer-reviewed papers
CAR-T/NK 세포 구축 Difficulty in culturing T/NK cells Over 16+ years of primary cell culture experience
It is time-consuming to assess the transfection conditions of T/NK cells; the identification of cells after transfection is difficult An optimized protocol for fully summarizing the transfection parameters of human/murine immune cells
체외 및 체내 killing assay Difficult to choose evaluation indicators Mature in vitro & in vivo pharmacodynamic experimental platform
Data analysis Extensive experience of both in vitro and in vivo assays, supported by successful publications and IND submissions
案例展示 사례 소개: 데이터 검증
1
CAR 분자 디자인 및 렌티바이러스 패키징
2
CAR-T세포의 제조
3
체외 효능 평가

CAR-T세포 요법의 경우 CAR 분자가 치료 효과의 핵심입니다. CAR 분자 구조에는 종양 항원을 인식하는 항체 single-chain variable regions 및 hinge regions, intracellular co-stimulatory도메인 및 신호 도메인이 포함됩니다. 그 디자인의 합리성은 살상 효과, 체내 지속성과 안전성 등에 영향을 미칠 것이다.따라서 다양한 종양 치료 표적에 대해 합리적이고 효과적인 CAR 분자를 디자인하고 후속 CAR-t 세포 구성을 위해 CAR 렌티 바이러스로 포장(package)해야 합니다.

CD19 항원 렌티바이러스 패키징및 역가(titer) 검출

CD19 항원을 발현하는 렌티 바이러스 정제 용액을 순차적으로 희석(0.01, 0.1, 1, 10μl)하고 동일한 수의 293T 세포에 각각 첨가하였다. 72시간 후, 유세포 분석(flow cytometry)은 293T 세포 양성률을 검출하여 바이러스의 Transduction titer 공식에 따라 계산했다.

그림 1. CD19 항원 렌티바이러스 역가의 검출 결과

그림 1에서 보는 바와 같이 transfected virus gradient가 증가함에 따라 CD19 antigen-positive 세포의 수가 점차 증가하여 렌티 바이러스가 우수한 감염 활성을 가짐을 나타내며, 바이러스 역가는 위의 공식에 따라 1.4×10^8 Tu/ml로 계산된다.

CD19-293T stably transfected cell line의 구축

위의 방법으로 293T 세포를 형질감염시켜 CD19 바이러스를 성공적으로 제조하고, 여러 번 스크리닝 후 거의 100%의 양성률로 CD19-293T 세포를 얻었다. 양성률 테스트 결과는 아래 그림과 같습니다.

그림 2. CD19-293T의 안정적인 형질전환 세포주의 양성률 테스트 결과
CD19-CAR 렌티바이러스 패키징 및 역가 검측

우리는 CD19 표적에 대해 설계된 2세대 고전 CAR 분자를 렌티 바이러스 벡터에 구축하고 CD19-CAR 렌티 바이러스를 패키지했습니다. 위의 방법을 사용하여 바이러스 역가를 검측하고 4.33×10^8 Tu/ml의 바이러스 역가를 계산했습니다.

그림 3. CD19 CAR의 분자 구조로, VH 및 VL 서열은 CD19 항체 FMC63 클론에서 파생된다
그림 4. CD19 CAR 렌티바이러스 역가 검측 결과
기타 렌티바이러스 감염: 다른 세포에 미치는 영향
그림 5. 렌티바이러스 감염이 다른 세포에 미치는 영향

CAR 바이러스의 패키징이 완료된 후 다음 단계는 T 세포를 형질감염시켜 CAR-T 세포를 얻는 것입니다. 우리는 고순도 T 세포(CD3+ 세포의 비율은 98% 이상)를 제조할 수 있는 두 가지 고효율 T 세포 제조 방법을 확립했지만 두 가지 방법으로 증폭된 서로 다른 아형 T 세포의 비율은 상당히 다릅니다.

방법 1에 의해 증폭된 T세포는 주로 CD8+T세포의 아형이며, 방법 2에 의해 증폭된 T세포 집단에서 CD8+T세포와 CD4+T세포의 비율은 거의 차이가 없다.두 방법 모두 서로 다른 아형 T 세포의 역할을 연구하기 위한 견고한 기초를 제공합니다.

그림 6. T세포 표현형 분석 실험 결과

만성 바이러스(LVs)는 CAR-T 세포를 구성하는 중요한 유전자 전달 도구이다.T 세포 활성화 및 증폭 방법의 차이, 형질감염 횟수 등과 같은 많은 요인이 CAR-T 세포의 양성률에 영향을 미칩니다. 우리는 다양한 실험 조건을 최적화하여 렌티바이러스 형질감염 기반 효율적인 CAR-T 세포 생산 공정을 성공적으로 확립했습니다.

아래 그림은 CD19 CAR-T 세포의 양성률 검출 결과를 보여준다.CD19 항체 FCM63 클론에서 파생된 단일 가닥 항체가 이 구조에 사용되었으므로 형질감염 효율은 항-fmc63 단일 가닥 항체에 의해 검출될 수 있었습니다.결과는 CD19 CAR-T 세포의 양성률이 45.59%에 도달할 수 있음을 보여주었고 높은 양성률의 CD19 CAR-T 세포를 성공적으로 구성했습니다.

그림 7. CD19 CAR-T 세포의 양성률 검측 결과

CAR-T 세포가 구축되면 관련 약물 효능 평가를 수행할 수 있습니다.일반적으로 CAR-T 세포가 표적 세포에 미치는 살상 효과를 관찰하기 위해 다른 effect-to-target 비율이 사용된다. 우리는 CD19 CAR-T 세포와 T 세포를 48시간 동안 다른 effect-target 비율의 Nalm6 세포와 함께 배양하고 flow cytometry 분석에 의해 종양 세포 사멸을 검측했습니다.

그림에서 보는 바와 같이 CD19 CAR-T 세포는 T 세포 그룹과 비교하여 다양한 유효 표적 비율 조건에서 Nalm6 세포에 대한 특정 세포독성 효과가 유의하게 향상되었습니다.

그림 8. FMC63 CAR-T 세포가 Nalm6 종양 세포를 죽이는 실험 결과
A. Nalm6 세포 표면 CD19 항원 양성률 검사 결과;
B. CD19 CAR-T 세포가 Nalm6 세포를 죽이는 결과;
C. CD19 CAR-T 세포에 의해 살해된 Nalm6 세포의 배양 상등액에서 IFN-γ항체 함량의 검측 결과.