CRISPR /Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 iPSCs의 유전자에 EGFP 형광 마커(700bp)를 삽입하였다. 그림과 같이 exon E2의 업스트림과 다운스트림에 sgRNA를 설계하였고 EGFP를 포함하는 도너(Donor) 서열도 설계하였다. RPN 방법을 이용하여 sgRNA와 도너(Donor)를 유도만능줄기세포에 형질감염시키고 EGFP 서열은 HDR(homology-directed repair) 경로를 통해 exon E2 서열 후반부에 삽입하였다.

그림 1: EGFP 녹인 방식 설계

PCR로 확인하고 시퀀싱한 결과, exon E2 서열 이후에 EGFP로 삽입된 이형 접합 유도만능줄기 세포주가 얻어졌다는 것을 확인하였다. 세포배양 후 G-밴드 염색체 분석(G banding)으로 핵형 분석을 진행한 결과 염색체 수는 46개로 정상이었고 구조적 이상은 없는 것으로 나타났다. 면역 형광 염색을 통해 3개의 전분화능(줄기 관련) 마커 유전자인 NANOG, OCT4, SOX2의 발현이 검출되었고 양성 신호가 관찰되어 유전자 편집된 녹인 세포가 전분화능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

마커

WT:2430bp; KI:3213bp

참고: 기본 설계 전략은 EGFP 서열 전체와 업스트림 및 다운스트림 게놈 서열의 일부를 증폭하는 것이다. EGFP 삽입이 없는 밴드 패턴은 2430bp이며 EGFP의 성공적인 삽입은 3213bp의 밴드를 초래할 것이다. 결과적으로 8개의 단일 클론(1~8번)이 2430bp와 3213bp 모두에 밴드를 가지고 있으며 이는 이러한 클론들이 EGFP를 성공적으로 삽입한 이형 접합 클론이라는 것을 나타낸다.

그림 2: iPS-EGFP KI 아가로스 겔 전기영동 확인 결과

KI 밴드 5' 서열:

AGGCAGAAACAGAAAAGAATGAAATATTCCGCCGGCAT--TGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCA

KI 밴드 3' 서열:

CGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA--AAGACTCTTGGCCTCTCCAGAGACGCCCCTTTCCTCGTCC

참고: KI 밴드 5' 서열은 EGFP 삽입 단편의 5' 말단 서열과 업스트림 게놈 서열의 일부를 표시한다. KI 밴드 3' 서열은 EGFP 삽입 단편의 3' 말단이고 다운스트림 게놈 서열의 일부이다. KI 밴드 5' 서열과 녹인 밴드 3' 서열의 시퀀싱 분석은 모두 EGFP와 일치하고 피크가 중첩되어 있다. 이는 클론이 EGFP 삽입 단편의 이형 접합 클론임을 증명해준다.

그림 3: iPS-EGFP KI 시퀀싱 결과

그림 4: iPS-EGFP의 핵형 분석(세포배양 후 G-banding 으로 핵형 분석을 진행한 결과 염색체 수는 46개로 정상이었고 염색체 구조에 뚜렷한 이상은 없는 것으로 나타났다)

그림 5: 전분화능 마커에 대한 iPS-EGFP 면역 형광 염색(NANOG, OCT4, SOX2, 이 3개의 전분화능 마커 유전자를 검출하기 위해 면역 형광 염색이 진행되었는데 3개의 마커 모두에서 양성 신호가 검출되었고 이는 형질감염된 세포가 전분화능을 가지고 있음을 보여주었다).