녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

Cyagen 새로운 칼럼 희귀 질환의십종죄 희귀 질환 연구에 집중하기 위해 희귀 질환의 원인 기전, 임상 치료 모델, 유전자 치료방법  다양한 관점에서 희귀 질환의 원인을 살펴보는 것을 목표로 합니다. 이러한 희귀 질환의 원죄를 탐구함으로써 보다 정교한 질병 모델을 개발하고 희귀 질환과 관련된 약물의 개발을 촉진하고자 합니다. 이번 세계 눈의  특집에서는 RHO 유전자 돌연변이로 인한 망막색소 변성증이라는 희귀 안과 질환에 대해 주목해보도록 하겠습니다.

 

RHO  관련 병원성 메커니즘 

RHO 연구는 1950 년대에 시작되었습니다. 1957  미국의 생화학자 George Wald 시각 반응에 필요한 감광성 색소,  로돕신 (Rhodopsin, RHO)[1] 발견했는데 Wald 발견은 나중에 가능한 시각적 복원 기술의 중요한 기반을 제공했습니다. RHO 돌연변이는 망막색소 변성증을 일으키는 주범입니다. 대부분의 RHO 돌연변이는 광수용체 세포에서 보라색 적색 단백질의 높은 수준의 발현을 유도하여 대량의 돌연변이 단백질의 비정상적인 국소화  세포 응집을 유발하여 광수용체 세포의 세포 사멸을 초래하고 정상적인  신호 전달 기능을 발휘할  없게 합니다. 그중 P23H RHO 돌연변이  가장 많은 비율을 차지하는 병원성 돌연변이입니다.

 

2000  , 연구자들은 야생형 RHO 유전자를 P23H 형질 전환 마우스 (마우스가 망막색소 변성증으로 고통받음) 옮겼으며, 전달 요법이 P23H 형질 전환 마우스의 광수용체 변성 속도를 크게 늦추는 것을 발견했습니다 [2]. 그러나 RHO 유전자 돌연변이로 인한 망막색소 변성증 (Retinitis Pignmentosa, RP)  RHO 발현을 보충해야만 치료할  있는 것일까요? RHO-adRP 같은 지배적인 질병의 경우 세포에 해로운 유전자 산물을 제거해야 하기 때문에 대답은 분명히 '아니요'라고 봅니다.

 

RHO 유전자 치료의 연구 진행 

RHO 관련 유전자 요법이 RP 1+1=1 방식으로 치료하는데 어떻게 사용될  있는지 (, 동일한 질병에 작용하는  가지 방법) 살펴보도록 하겠습니다.

 

• AAV전달 

Roche Spark 공동 개발한 약물 RhoNova  AAV2/5 전달 shRNA 통해 내인성 RHO 돌연변이 유전자 발현 억제 + 야생형 RHO 유전자 발현 보충 = RHO 돌연변이로 인한 RP(shRNA+WT-RHO=RP) 치료임상 연구에서는 P23H 형질전환 마우스를 약효 연구 모델로 사용했습니다[3].

 

그러나, 초기 임상 실험은 shRNA 억제 효과가  질환 모델  인간 세포에서 효과적이지만, 마우스에서 Rho 서열에서는 보존되지 않는다는 것을 보여주었습니다[4]. 이것은 P23H 형질전환 마우스 모델  내인성 Rho 유전자가 인간 RHO 유전자와 완전히 일치하지 않기 때문에 생체내 환자 효능과 일치하는 매우 효율적인 shRNA 스크리닝 하는  결함이 있음을 나타내고 있으므로 RP관련 유전자 치료 연구를 위한 이상적인 임상 질환 모델이 아닙니다.

 

RHO 표적으로 삼는 CRISPR 치료 

장펑(张锋) 설립  Editas RHO 돌연변이로 인한 RP 치료를 위한 생체  유전자 편집 요법 EDIT-103 관련 결과를 발표했습니다. EDIT-103  전달 녹아웃과 광수용체 기능을 보존하기 위해 돌연변이 RHO 유전자를 보완하는 이중 AAV5 벡터를 사용한 돌연변이 독립적 CRISPR/Cas 기반으로 하는 유전자 편집 요법입니다.  치료법은 150  이상의 RHO 돌연변이로 인한 RP 해결할 것으로 예상됩니다. 또한, RHO 돌연변이에 의해 야기된 RP(Cas+WT-RHO=RP) 치료하기 위해  gRNA  Cas 통한 돌연변이 RHO 발현을 억제하여 야생형 RHO 유전자의 발현을 보충할  있습니다.

 

 임상 동물 모델에서 매우 효율적이고 특이적인 gRNA 스크리닝 하기 위해 연구원들이 인간화 RHO 마우스 모델 매우 영리하게 사용했다는 점을 주목해야 하는  (mRhohRHO/+),  인간 RHO 유전자가 제자리에서 마우스 Rho 유전자를 대체합니다. 임상 연구에 따르면 hRHO 일반적으로 마우스에서 발현되며 EDIT-103  인간화된 RHO 마우스에서 상당한 녹아웃  전달 효과를 나타냅니다 [5]. RP 관련 유전자 치료에서 인간 유전자를 운반하는 질병 모델이 고효율  특정 약물을 선별하는  필요하며 인간화 질병 모델 마우스는 RP 관련 약물 개발에서  나은 질병 모델이라는 것을 찾기가 어렵지 않습니다.

 

게놈 전체 인간화 모델의 HUGO-GT™

RHO 돌연변이로 인한 RP 외에도 Editas CEP290 돌연변이로 인한 선천성 흑내장 10 , USH2A 돌연변이로 인한 Usher 증후군, SERPINA1 돌연변이로 인한 α-1 트립신 결핍, CFTR 돌연변이로 인한 낭포  섬유증  기타 질병 파이프 라인을 발표했는데  파이프 라인의 임상 질병 모델은 모두 인간화된 마우스를 사용합니다.

 

신약의 연구 개발을 가속화하기 위해  [차세대 게놈 전체 인간화 모델 구축 계획] HUGO-GT™ Program  등장했습니다 (HUGO-GT: Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy). , 희귀 질환 데이터 센터 RDDC (질병-유전자-동물 모델-약물 임상 정보를 얻기 위한  스톱 생물학적 데이터 플랫폼) 기반으로 cyagen TurboKnockout 기술과 BAC 융합 기술을 통해 대형 게놈 조각의 교체를 실현하여 유전 질환 연구  유전자 치료 약물 개발에  적합한 게놈 전체 인간화 모델을 구축했습니다.

 

 

안과 질환 분야에서 Cyagen 독자적으로 개발한 전체 게놈 인간화 마우스에는 야생형 전체 게놈 인간화 마우스 hRHO  이를 기반으로 구축된  P23H  돌연변이 질병 모델 hRHO-P23H , 그리고  hCEP290  같은 기타 안과 모델이 포함됩니다.

 

관련 질병 

표적 유전자

대상 유형 

망막색소변성증 

Rho

KO、CKO、Humanization(WT、MU)

Mertk

KO、CKO

Rpgr

KO、CKO

Crb1

KO、CKO

Rd1(Pde6b)

MU、KO

Rd10(Pde6b)

MU

Rp2

KO、CKO

황반 변성 

Vegfa

Humanization(KI、TG)

Abca4(Abcr)

KO、CKO、Humanization

만성 망막 변성 

Prph2

KO、CKO

선천성 흑내장 2  

Rpe65

KO、MU

선천성 흑내장 4

Aipl1

KO、CKO

선천성 흑내장 10

Cep290

KO、CKO、Humanization(WT、MU)

선천성 흑내장 13

Rdh12

KO、CKO

완전색맹 

Cnga3

KO、CKO

각막 내피 이영양증 

Tcf4

KO、CKO、Humanization

선천성 무홍채증 

Pax6

KO、CKO

범맥락막위축 

Chm

KO、CKO

Usher 증후군 

Ush2A

Humanization(WT、MU)

Myo7A

CKO

BVMD

Best1

KO、CKO

유전성 퇴행성 망막층간분리 

Rs1

KO、CKO

범발성백색증 1 

Tyr

CKO

범발성백색증 3

Tyrp1

KO、CKO

알비노 증후군 

Gpr143

KO、CKO

Bietti 결정성 각막 이영양증 

Cyp4v3

KO、CKO

각막 이영양증 

Tgfbi

KO、CKO、MU、Humanization

Wolfram 증후군 

Wfs1

KO、CKO

탄력섬유성 위황 색종 

Abcc6

KO、CKO

망막색소변성증, 선천성 흑내장 

Tub

KO、CKO

Enhanced S Cone syndrome

Nr2e3

KO、CKO

 

참고문헌

Wald G .THE MOLECULAR BASIS OF VISUAL EXCITATION[J]. American Scientist, 1954, 42(1):73-95.

Lavail M M ,  Yasumura D ,  Matthes M T , et al. Ribozyme rescue of photoreceptor cells in P23H transgenic rats: Long-term survival and late-stage therapy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(21):11488-11493.

Meng D ,  Ragi S D ,  Tsang S H . Therapy in Rhodopsin-Mediated Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa[J]. Molecular Therapy, 2020, 28(10).

Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018, 115(36):E8547-E8556.

https://ir.editasmedicine.com/news-releases/news-release-details/editas-medicine-presents-preclinical-data-edit-103-rhodopsin-0

 

2006 년에 설립된 Cyagen은 데이터, 알고리즘, 모델로 신약 개발을 가속화하는 혁신적인 CRO 기업으로, 동물 모델 맞춤화부터 유전자, 세포 치료 업무에 이르기까지 고객의 요구를 전방위적으로 충족합니다.
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