코로나바이러스(COVID-19) 연구용 유도성 인간화 ACE2 마우스 모델

연구 배경

신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 감염으로 인한 COVID-19 팬데믹은 전 세계적으로 3억 3천만 명 이상의 감염자를 발생시켰습니다. SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질은 숙주 수용체 인식과 바이러스 및 세포막 융합을 담당하여 바이러스가 숙주 세포에 감염되도록 합니다.

현재 유행하는 변이주는 스파이크 단백질에 여러 돌연변이가 존재하여 백신 설계 업데이트에 어려움을 주고 있습니다. SARS-CoV-2의 S 단백질은 S1 소단위체와 S2 소단위체의 두 단편으로 구성됩니다. 아미노 말단에 위치한 S1 소단위체는 숙주의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체를 인식하고 상호작용하는 수용체 결합 도메인(RBD)을 포함합니다. 카르복시 말단에 위치한 S2 소단위체는 바이러스와 세포막의 융합을 촉매하여 바이러스 RNA가 세포 내로 방출되고 감염된 세포 내에서 바이러스 복제의 생물학적 과정이 시작되도록 촉진합니다. 바이러스 감염 메커니즘에 대한 연구는 현재 팬데믹 억제와 향후 코로나바이러스 발병 예방의 주요 핵심 분야입니다. 숙주의 ACE2 단백질이 바이러스 스파이크 단백질과 결합할 수 있다는 사실이 밝혀졌지만, 결합의 분자 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다.

2021년 12월 21일, 국제 종합 학술지 PNAS에 연구가 게재되었습니다. 중국과학대학교 멩광쉰(Meng Guangxun) 팀과 드미트리 라빌렛(Dimitri Lavillette) 팀 등의 협력으로 진행된 이 연구는 SARS-CoV-2 S2' 단편의 생성과 이 단편이 바이러스와 수용체 간의 인식 및 막 융합에서 하는 역할을 밝혔습니다.

기술 경로

본 연구는 살아있는 세포에서 바이러스 스파이크(S) 단백질이 수용체 ACE2와 어떻게 결합하는지 탐구했습니다. 연구진은 ACE2 단백질이 감염 과정에서 중요한 역할을 하며 스파이크 단백질 상의 핵심 아미노산이 단백질 가수분해에 필수적이라는 점을 조사하기 위해, 세포-세포 융합 기술을 사용하여 다양한 세포주와 인간화 ACE2(hACE2)가 녹인된 마우스에서 분리한 일차 세포를 분석했습니다. 그들은 ACE2 단백질이 바이러스 스파이크의 가수분해를 촉진하여 S2' 단편을 생성하며, 이 중요한 가수분해 단계가 스파이크 매개 막 융합에 중요하다는 것을 발견했습니다.

그림 1. 본 연구에서 저자들은 시험관 내 세포-세포 융합 시스템을 사용했습니다. 다양한 세포에서 S 단백질을 발현시킨 후 ACE2 수용체가 있거나 없는 세포와 공동 배양하여 융합 과정 동안 S 단백질의 효소 절단 반응, 세포막 융합 및 감염 메커니즘을 검출했습니다 [1].

ACE2 존재 시 스파이크에 의한 합포체 형성이 S2' 단편 생성과 연계됨

살아있는 세포에서 스파이크(S) 단백질이 수용체 ACE2와 결합할 때의 기능적 및 생화학적 특성을 조사하기 위해, 연구진은 세포-세포 융합 분석을 사용하여 합포체에서 잠재적으로 절단된 스파이크 단백질 산물을 얻었습니다.

스파이크를 발현하는 HEK293T 세포에 HEK293T-ACE2 세포를 첨가한 후 합포체를 용해시키고 연구진은 HEK293T 합포체 용해물에서 스파이크 단백질 산물의 면역침강을 수행했습니다. 결과는 ~68 kDa의 추가적인 밴드 S2'가 검출된 반면, 대조군 세포는 스파이크 단백질만 발현하고 S2' 밴드는 존재하지 않았습니다. 또한 S2' 밴드의 밝기는 첨가된 ACE2 발현 세포의 수에 따라 달라져, ACE2가 증가하면 스파이크 단백질의 단백질 가수분해 처리가 촉진된다는 것을 시사합니다.

그림 2. ACE2 존재 시 스파이크에 의한 합포체 형성이 S2' 절단과 연계됩니다 [1].

S2' 부위 절단에는 기능성 ACE2의 특이적 인식이 필요함

이전 연구에서는 마우스 ACE2를 발현하는 세포가 야생형 SARS-CoV-2 스파이크 매개 감염에 내성이 있다는 것이 입증되었으므로, 연구진은 인간과 마우스 ACE2 변이체에 의해 생성된 S2' 단편이 동일한 효과를 갖는지 조사했습니다.

이 가설을 테스트하기 위해 연구진은 공동면역침강(Co-IP) 실험을 설계하여 다른 종의 ACE2 단백질의 차이를 검증했습니다.

연구진은 마우스 ACE2 단백질이 스파이크 단백질의 RBD 도메인과 결합할 수 없는 반면 인간 ACE2 단백질은 결합할 수 있다는 것을 발견했습니다. 뿐만 아니라 인간 ACE2 단백질은 전장 스파이크 단백질과도 상호작용할 수 있지만 마우스 단백질은 그렇지 못했습니다.

일차 세포에서 스파이크에 의한 합포체 형성을 모방하기 위해, 연구진은 Cyagen에 의뢰하여 인간 ACE2 유전자 녹인 마우스(H11 유전자좌) 모델을 생성하고 녹인 마우스의 폐 상피 세포를 분리했습니다. 이 마우스 계통은 "K18 프로모터-Kozak-인간 ACE2 CDS-P2A-CreERT2-rBGpA" 카세트를 가지고 있어 인간 ACE2 수용체와 CreERt2를 모두 발현하므로, 코로나바이러스 감염에 대한 반응에서 특정 숙주 유전자(floxed)의 유도 조직에서의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. C57BL/6J 배경의 K18 프로모터 구동 hACE2-Cre-ERT2 녹인(hACE2 KI) 마우스는 Cyagen에 의해 생성되었으며 기술된 실험을 위해 유지되었습니다. 뿐만 아니라 연구진은 S2' 밴드를 검출하고 합포체 형성의 녹색 형광 신호를 관찰했습니다.

그림 3. S2' 생성에는 기능성 ACE2의 특이적 인식이 필요합니다 [1].

스파이크 단백질의 아르기닌 815 잔기는 S2' 절단에 필수적임

SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 여러 위치에서 절단될 수 있으며, 가장 주목할 만한 것은 S1/S2 접합부(685) 또는 S2' 부위(815)에 있는 균주 간 보존된 아르기닌 잔기입니다. 그 기능을 연구하기 위해 연구진은 이 두 위치의 아르기닌을 알라닌으로 돌연변이시켰습니다.

실험 결과, HEK293T 세포에서 발현된 R815A 돌연변이를 포함하는 스파이크는 단백질이 S2'를 가수분해할 수 없게 하여, 스파이크 상의 815번 위치 아르기닌이 S2' 가수분해에 필수적이라는 것을 보여주었습니다.

그림 4. 스파이크 아르기닌 815는 S2' 절단에 필요합니다 [1].

요약

위의 실험들은 스파이크 단백질이 가수분해되어 S2' 단백질을 형성하는 것이 코로나바이러스 감염 과정에서 필수적인 분자 이벤트 중 하나이며, 815번 위치의 아르기닌이 가수분해 절단에 필요하다는 것을 증명합니다.

Cyagen의 ACE2 마우스 모델: 코로나바이러스 과학 연구 지원

Cyagen은 자체 독점 TurboKnockout™ 기술과 최적화된 타겟 유전자 편집 기술을 사용하여 BALB/c, C57BL/6J, C57BL/6N의 세 가지 배경 계통의 ACE2 마우스를 제작했습니다. 다양한 유전자 편집 방법의 장단점을 고려하여, 다양한 연구 목적과 다양한 적용 방향에 대한 고객의 요구를 충족시키기 위해 다양한 유전자 타겟팅 방안과 구축 전략이 설계되었습니다. 동시에 우리는 COVID-19 연구자들에게 ACE2 마우스 모델의 검증 데이터 보고서를 제공할 수 있습니다. 새롭게 개발된 C57BL/6J 배경의 K18 프로모터 구동 hACE2-Cre-ERT2 녹인(hACE2 KI) 마우스 모델은 지속적인 연구를 위한 추가 플랫폼을 제공합니다. 신종 코로나바이러스 연구 관련 마우스 모델이 필요하시면 문의하시거나 서비스@cyagen.kr로 상담 및 주문하실 수 있습니다.

참고문헌

[1] Shi Yu, Xu Zheng, Bingjie Zhou, Juan Li, Mengdan Chen, Rong Deng, Gary Wong, Dimitri Lavillette, Guangxun Meng, SARS-CoV-2 spike engagement of ACE2 primes S2’ site cleavage and fusion initiation. Proceedings of the National Academy of Sciences Jan 2022, 119 (1) e2111199119; DOI: 10.1073/pnas.2111199119

https://www.pnas.org/content/119/1/e2111199119