NLRP3 and Familial Cold Autoinflammatory Syndrome
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NLRP3 유전자 소개
Nlrp3 유전자는 pyrin 도메인을 포함하는 단백질을 코딩합니다. 해당 단백질은 pyrin 도메인 외에도 뉴클레오티드 결합 부위(NBS) 도메인과 류신이 풍부한 반복 서열(LRR) 도메인으로 구성되어 있습니다. 이 단백질은 세포 사멸과 관련된 스팟 형태 단백질인 PYCARD/ASC와 상호작용하며, PYCARD/ASC는 caspase 모집 도메인을 포함하고 있어 NLRP3 염증소체 복합체의 구성 요소입니다. 해당 복합체는 NF-κB 신호 전달 경로의 상류 활성 인자로 작용하여 염증 반응, 면역 반응 및 세포 사멸 조절에 중요한 역할을 합니다.
그림 1. 염증소체의 분자 메커니즘 설명도 [1]
IL-1β는 내인성 발열원으로도 불리며 강력한 염증 유발 사이토카인입니다. IL-1β의 생성은 최소 세 가지 다른 과정의 엄격한 조절을 받습니다. 첫 번째 단계는 pro-IL-1β 단백질의 생성이며, 이후 전구체 단백질이 분해되어 활성형 IL-1β 단백질이 생성되고 최종적으로 세포 외부로 방출됩니다. 이 중 pro-IL-1β의 가공 단계는 활성화된 caspase-1을 필요로 하며, 염증소체가 해당 과정의 핵심 조절 인자로 잘 알려져 있습니다. NLRP3 염증소체는 활성화되지 않은 pro-caspase-1을 활성형 caspase-1으로 가공하고, pro-IL-1β를 성숙한 IL-1β로 분해하여 염증 반응과 세포의 조기 사멸을 유도합니다.
Cryopyrin을 코딩하는 NLRP3 유전자의 우성 유전 돌연변이는 일련의 염증성 질환의 원인으로 확인되었습니다. 가족성 추위 자가염증후군(FCAS), Muckle-Wells 증후군(MWS), 신생아 다기관 염증성 질환(NOMID) 등이 포함되며, 현재 이러한 질환을 총칭하여 냉열단백질 관련 주기성 증후군(CAPS)이라고 부릅니다.
| 구분 | 인간 | 마우스 | 랫드 |
| 염색체 위치 | 1번 | 11번 | 10번 |
| 유전자 전장(bp) | 32654 | 24270 | 24246 |
| mRNA 길이(nt) | 4187 | 4020 | 3857 |
| 엑손 수 | 10 | 10 | 9 |
| 아미노산 수 | 1034 | 1033 | 1035 |
| 상동 유전자 | NLRP12, NLRP14, NLRP9, NLRP1, NLRP4 등 | ||
| 관련 질환 | Familial Cold Autoinflammatory Syndrome(FCAS) | ||
| Cyagen 마우스 모델 | |||
| 상태 | 맞춤 제작 | 정자 은행(Ebank) | 생체 보유 |
| 유전자 녹아웃(KO) | ✔ | ✔ | ✔ |
| 조건부 녹아웃(cKO) | ✔ | ✔ | |
표 1. NLRP3 관련 유전자 정보 및 Cyagen 모델 보유 현황
비고: ✔로 표시된 항목은 Cyagen 마우스 창고에 보존된 모델입니다.
가족성 추위 자가염증후군(FCAS)
가족성 추위 자가염증후군(FCAS)은 희귀한 유전성 염증성 질환입니다. 간헐적으로 발생하는 발진, 발열, 관절통 등 추위 노출로 인한 전신 염증 증상이 특징이며, FCAS의 발병은 영아기나 유아기에 시작되어 환자의 일생 동안 지속되는 경향이 있습니다. FCAS는 대부분 상염색체 우성 유전 방식으로 유전되며, 냉단백질(NALP3) 단백질을 코딩하는 CIAS1-NLRP3 유전자의 이형 접합 돌연변이에 의해 발생합니다. 해당 유전자 돌연변이가 냉단백질을 포함하는 단백질 복합체인 염증소체의 활성화를 증가시켜 체내 염증 반응이 과도하게 일어나는 것으로 추정됩니다. 염증소체의 활성이 증가하면 IL-1β라는 단백질의 방출이 늘어나 발열, 관절통과 같은 염증 증상이 유발됩니다.
FCAS는 비교적 새롭게 발견된 질환이기 때문에 정확한 발병률은 아직 알려지지 않았습니다. 신생아 다기관 염증성 질환(NOMID)과 Muckle-Wells 증후군(MWS) 증상은 FCAS 증상과 유사하며 표현형이 중복되는 경우가 많습니다. 가족성 추위 자가염증후군 1형(FCAS1)은 NLRP3 유전자의 이형 접합 돌연변이로 인해 발생하며 염색체 1q44에 위치합니다. 또한 FCAS2는 염색체 19q13에 있는 NLRP12 유전자 돌연변이, FCAS3은 염색체 16q23에 있는 PLCG2 유전자 돌연변이, FCAS4는 염색체 2p22에 있는 NLRC4 유전자 돌연변이로 인해 발생합니다.
그림 2. cryopyrin-associated periodic syndromes(CAPS)의 임상 스펙트럼 [2]
| 가족성 추위 자가염증후군(FCAS) | |
| 유병률 | 정확한 발병률을 확인하기 어려움 |
| 주요 증상 | 발열, 발진, 관절통 |
| 발병 연령 | 유아기에 발병하여 환자의 일생 동안 지속 |
| 성별 특징 | 남성과 여성의 발병 위험이 동일 |
| 원인 유전자 | NLRP3 |
| 유전 방식 | 상염색체 우성 유전 |
표 2. FCAS 질병 관련 주요 정보
Nlrp3 유전자 편집 마우스 표현형
1. 점 돌연변이 모델
알라닌 352번이 발린으로 치환(A352V)되는 돌연변이와 류신 353번이 프롤린으로 치환(L353P)되는 돌연변이는 각각 전형적인 MWS와 FCAS 환자와 밀접한 관련이 있으나, 증상이 중복되는 증후군 환자에서는 관련성이 낮은 것으로 알려져 있습니다. ES 세포 표적 기술을 통해 두 가지 점 돌연변이 마우스 모델인 Nlrp3 A350V와 Nlrp3 L351P를 제작할 수 있습니다. 인트론 내부에 Neo 카세트가 존재하면 유전자의 정상적인 발현이 차단되기 때문에, 각기 다른 프로모터로 Cre 재조합 효소를 발현하는 마우스와 교배하면 Neo 카세트가 제거되어 특정 조직에서 돌연변이 유전자가 발현됩니다.
그림 3. Nlrp3 점 돌연변이 마우스 타겟 전략 [3]
Nlrp3 A350V/+ / CreZ(배아기 단계에서 Neo 카세트가 제거되어 돌연변이 유전자가 전신 발현) 새끼는 생후 1~2일 또는 그 이전부터 염증 표현형을 나타내며, 4일째에는 피부 농양과 비늘 모양 홍반이 관찰됩니다(그림 3A). 또한 해당 마우스는 생후 4일부터 성장 지연, 색소 침착 저하 및 모발 성장 부족 현상이 나타납니다. Nlrp3 A350V/+ / CreL(골수 세포주에서 Neo 카세트가 제거되어 돌연변이 유전자가 발현) 새끼는 유사한 표현형을 보이지만 사망률 양상이 달라 70%의 개체가 생후 7~9일까지 생존한 뒤 점차 사망률이 증가합니다.
그림 4. Nlrp3 점 돌연변이 마우스 관련 표현형 데이터 [3]
MWS 환자에서 관찰되는 두드러기 유사 병변과는 다르지만, A350V 돌연변이를 발현하는 새끼에서 관찰되는 피부 홍반, 농양, 비늘은 잠재적인 염증 반응이 존재함을 시사합니다. 돌연변이 마우스는 전체 백혈구 수가 경미하게 증가할 뿐 아니라 중성구와 혈소판 수가 명확하게 증가하는 특징이 있습니다. 이러한 혈액학적 및 피부 검사 결과는 CAPS 환자에서 공통적으로 관찰되는 소견과 일치합니다. Nlrp3 A350V/+/CreL 새끼의 염증성 피부 절편을 이용해 IL-1β와 IL-6에 대한 면역조직화학 염색을 진행한 결과, 두 사이토카인의 발현이 증가하는 것을 확인했습니다(주로 진피에서 IL-1β, 표피에서 IL-6 발현이 증가). 이는 CAPS 환자의 피부 생검 결과와 일치하며, 해당 사이토카인이 피부 병리 기전에 중요한 역할을 함을 암시합니다. 반면 TNFα의 발현은 앞서 보고된 CAPS 환자와 큰 차이가 없었습니다.
그림 5. Nlrp3 점 돌연변이 마우스의 혈청과 피부 내 다양한 세포인자 상향 조절 [3]
2. 녹아웃 마우스 모델
ES 세포 표적 기술을 통해 Nlrp3(Cias1) 녹아웃 마우스 모델을 제작할 수 있으며, ATG 시작 코돈 위치에 EGFP를 삽입하여 유전자 녹아웃 효과를 얻을 수 있습니다:
그림 6. Nlrp3 유전자 녹아웃 마우스 타겟 전략 [5]
야생형, Nlrp3+/- 및 Nlrp3-/- 대식세포는 모두 상당한 양의 pro-IL-1β를 생성하지만, 야생형 대식세포와 달리 Nlrp3-/- 대식세포는 ATP 처리 후 pro-IL-1β를 절단하지 못하는 특징이 있습니다. 이는 Cryopyrin이 ATP 유도 caspase-1 활성화에 필수적인 역할을 함을 보여줍니다. LPS 또는 Pam3CSK4로 자극한 야생형 대식세포는 나이지리아균이나 마이토톡신 처리 시 IL-1β와 IL-18을 분비하는 반면, Asc-/-와 Nlrp3-/- 대식세포는 모두 유의한 수준의 IL-1β 또는 IL-18을 분비하지 못합니다.
CAPS의 치료
대부분의 CAPS는 NLRP3 유전자 돌연변이에 의해 발생합니다. 변이된 유전자 산물인 cryopyrin은 염증소체를 활성화시켜 IL-1β의 과도한 생성을 유발하며, IL-1β가 CAPS의 염증 증상을 일으키는 핵심 매개 인자입니다. IL-1 억제제의 개발로 인해 이전까지 치료가 어려웠던 이러한 파괴적인 질환에 안전하고 효과적인 치료 옵션이 제공되었습니다.
NSAIDs는 종종 관절 통증 완화 목적으로 사용됩니다. 고용량 코르티코스테로이드는 일정 수준의 효과가 입증되었지만 단기 및 장기 부작용을 유발할 수 있어 사용에 주의가 필요합니다.
Regeneron Pharmaceuticals의 Arcalyst(Rilonacept)는 IL-1 차단제로, 2008년 FDA 승인을 받아 성인과 12세 이상 소아의 CAPS(FCAS 및 MWS 포함) 치료에 사용되고 있습니다.
Biovitrum Pharmaceuticals의 Kineret(Anakinra)는 IL-1 수용체 길항제로 FCAS 환자에게 널리 사용되고 있으며 임상 효과가 매우 높은 것으로 알려져 있습니다. 다만 현재 FCAS를 비롯한 CAPS 질환 치료에 대한 정식 적응증은 승인되지 않은 상태입니다.
결론
향후 연구에서는 cryopyrin의 활성화 돌연변이가 어떻게 염증소체의 정상적인 조절 기작을 회피하여 가족성 추위 자가염증후군, Muckle-Wells 증후군, 신생아 다기관 염증성 질환 등의 염증성 질환을 유발하는지에 대한 기전을 밝히는 것이 필요합니다. 한 가지 흥미로운 가능성으로는 낮은 수준의 세균 감염과 불균형한 냉열단백질 반응이 이러한 질환과 관련된 증상을 유발할 수 있다는 가설이 제기되고 있습니다.
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참고 문헌:
1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.
2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.
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4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.
5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.
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