새로운 연구에서 HEG1이 동맥경화에서의 보호적 역할을 규명합니다

죽상동맥경화증(Atherosclerosis)은 심혈관 질환의 병리학적 기반으로, 발병 부위에 뚜렷한 편향성을 보입니다. 주로 혈관 분지부 및 곡률 부위에서 우선적으로 발생하며, 이러한 영역은 교란된 혈류 패턴(d-flow)에 노출되어 있습니다. 반면, 직선적이고 분지되지 않은 혈관 구간은 안정적인 혈류(s-flow)의 영향을 받아 동맥경화 발생 가능성이 상대적으로 낮습니다.

S-flow는 내피세포 표면에 단방향 층류 전단응력(Unidirectional laminar shear stress, ULS)을 전달하여 내피세포 항상성을 유지하고 항동맥경화성 재프로그래밍 반응을 유도합니다. 이에 반해, d-flow로 인해 발생하는 진동성 저진폭 전단응력(Oscillatory shear stress, OSS)은 염증 반응, 혈관 투과성 증가, 세포 사멸 등 동맥경화를 촉진하는 변화를 유발합니다. 이러한 서로 다른 혈류 조건에 따른 내피세포의 변화는 주로 혈류 감지 유전자의 전사 조절을 통해 매개됩니다. 따라서 혈류 감지 유전자의 기능적 특성을 규명하는 것은 동맥경화 형성의 분자적 기전을 이해하고 새로운 치료 타겟을 발굴하는 데 있어 중요한 의미를 갖고 있습니다.

HEG1은 단일 막 관통(Single-pass transmembrane) 점액단백질 유사 당단백질로, 내피세포에서 고수준으로 발현됩니다. 기존 연구에 따르면, 마우스 및 제브라피시에서 heg1을 Knockout할 경우 심장 및 혈관 발달의 중대한 이상으로 인해 배아 치사가 발생합니다. 그러나 성체 동물의 혈관 내피세포에서 HEG1이 혈류 반응 및 동맥경화 형성 과정에서 수행하는 역할은 명확히 규명되지 않았습니다.

미국 조지아 공과대학교(Georgia Institute of Technology)와 에모리 대학교(Emory University)의 연구진은 HEG1이 s-flow 조건에서 발현이 증가하고 d-flow 조건에서 감소하며, KLF2/4(Kruppel-like factor 2/4)에 의존적인 방식으로 s-flow 유도 항동맥경화 반응을 매개함을 규명하였습니다. 이 연구는 국제 학술지 Circulation에 게재되었으며, HEG1–KLF2/4 축이 죽상동맥경화증의 잠재적 치료 타겟이 될 수 있음을 시사합니다.

연구 재료 및 방법

연구진은 마우스 부분 경동맥 결찰술(Partial carotid ligation,PCL) 모델의 단일세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 데이터를 재분석했습니다. 면역염색 및 qPCR 실험을 통해 마우스 동맥, 인간 대동맥 내피세포(HAEC), 그리고 인간 관상동맥에서 HEG1 발현을 분석했습니다. siRNA를 이용한 HEG1 Knockdown을 통해 서로 다른 혈류 조건에서 인간 대동맥 내피세포(HAEC)내 HEG1의 기능과 신호 전달 기전을 분석했습니다.

또한, Cyagen의 HEG1fl/+ 마우스 모델을 활용하여 타목시펜(Tamoxifen) 유도형 내피세포 특이적 HEG1 Knockout 마우스(HEG1^iECKO) 모델을 구축하였으며, 급성(PCL 수술) 및 만성(Western Diet) 동맥경화 모델을 구축했습니다. 이를 통해 성별 및 동맥 위치에 따른 플라크 형성 양상을을 평가했습니다.

기술적 연구 흐름(Workflow)

• 마우스 PCL 모델의 단일세포 RNA-seq 데이터 재분석을 통해 HEG1을 혈류 감지 유전자로 규명합니다.
• 면역염색 등을 활용하여 in vivo 및 in vitro 조건에서 HEG1의 발현 수준과 세포 내의 위치를 평가합니다.
• siRNA Knockdown 등 기술을 통해 다양한 혈류 조건에서 HEG1의 분자 작용 기전을 규명합니다.
• HEG1^iECKO 마우스를 이용해 급성 및 만성 동맥경화 모델을 구축하고, 플라크 형성에서 HEG1의 역할을 규명합니다.

연구 결과

혈류가 HEG1 발현 및 세포 내의 위치를 조절합니다

연구진은 기존에 PCL 수술을 통해 마우스 급성 동맥경화 모델을 구축하고, 좌측 총경동맥을 d-flow에, 우측 총경동맥을 s-flow에 노출시켜 대조군으로 사용하였습니다. 단일세포 RNA-seq 데이터 재분석 결과, Heg1은 주로 내피세포에서 발현되는 혈류 감지 유전자로 확인되었습니다. D-flow에 노출된 내피세포와 비교했을 때, s-flow 조건의 내피세포에서 Heg1 발현이 현저히 증가했습니다. 이는 Heg1 발현이 혈류 조건에 민감하며, s-flow에 의해 상향 조절되고 d-flow에 의해 억제됨을 의미합니다.

In vivo 결과를 검증하기 위해 Cyagen은 인간 대동맥 내피세포(HAEC)를 ULS(s-flow 모사) 또는 OSS(d-flow 모사) 조건에 노출시키고, 정적 조건(static condition)을 대조군으로 설정했습니다. OSS 및 정적 조건과 비교했을 때, ULS에 24시간 노출된 인간 대동맥 내피세포(HAEC)에서는 HEG1 mRNA 및 단백질 발현이 유의하게 증가하였습니다(그림 1).

흥미롭게도, ULS 처리 후 HAEC 배양 상층액에서도 HEG1 단백질이 검출되었습니다. 면역형광 현미경을 이용한 분석 결과, ULS 조건에서 HEG1은 혈류 하류 방향으로 극성화된 분포를 나타냈습니다(그림 1). 이러한 결과는 혈류가 HEG1의 유전자 및 단백질 발현뿐만 아니라, 단백질의 극성 위치 조절 및 배지 내 분비까지도 조절함을 시사합니다.

그림 1. ULS는 HEG1 mRNA 및 단백질 발현을 유도하고, 단백질의 배지 내 방출을 촉진합니다.

HEG1이 혈류에 민감한 유전자임을 확인한 후, 연구진은 혈류 조건에서 인간 대동맥 내피세포(HAEC)에 대해 siRNA를 이용한 Knockdown 실험을 수행하여 HEG1의 기능을 검증했습니다. 예상대로, ULS는 HAEC에서 단핵구 부착, 투과성 및 세포 이동 반응을 억제하였으며, HEG1 Knockdown은 이러한 억제 효과를 역전시켰습니다. 또한 HEG1 Knockdown은 ULS에 의해 매개되는 VCAM1 억제 및 eNOS 유도를 차단했습니다. 이러한 결과는 s-flow에 의해 유도되는 내피 기능 조절 과정에서 HEG1이 핵심적인 역할을 수행함을 시사합니다.

HEG1의 분자적 작용 기전

그 다음으로 연구진은 HEG1이 매개하는 s-flow 작용의 분자 기전을 심층적으로 분석했습니다. 연구진은 HEG1이 s-flow에 의해 유도되는 두 가지 핵심 전사인자 KLF2/4의 발현을 조절할 것이라는 가설을 설정했습니다. 이를 검증하기 위해 siHEG1 및 ULS 처리를 수행한 HAEC에서 KLF2/4의 mRNA 및 단백질 발현을 분석하였습니다. 그 결과, ULS는 KLF2/4 발현을 유의하게 유도하였으며, HEG1 Knockdown은 이러한 효과를 현저히 억제했습니다. 이는 HEG1이 ULS에 의해 유도되는 KLF2/4 발현을 조절함을 의미합니다.

ULS는 내피세포에서 MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2 신호 경로를 활성화하여 KLF2/4 발현을 조절하는 것으로 알려져 있으나, 그 upstream 조절 기전은 명확하지 않았습니다. 연구진은 ULS가 ERK5 인산화를 증가시키는 반면, HEG1 Knockdown은 이러한 ERK5 인산화를 약화시킨다는 사실을 확인하여, HEG1이 ERK5 조절에 관여한다는 핵심적인 근거를 제시했습니다. 일련의 억제제 실험 결과를 종합하면, HEG1은 ULS에 의해 유도되는 MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2 경로의 upstream 조절 인자로 작용함을 알 수 있습니다.

그렇다면 HEG1은 어떻게 MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2 경로를 조절하나요? KRIT1은 MEKK3 활성의 억제 인자로 알려져 있으나, 혈류에 의해 유도되는 MEKK3–KLF2/4 경로를 조절하는지는 명확하지 않았습니다. 연구진은 siRNA를 이용한 KRIT1 Knockdown을 진행한 후, ULS에 의해 유도되는 ERK5 인산화 및 KLF2/4 발현이 현저히 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 KRIT1이 MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2 경로의 혈류 활성화 과정에서 억제 역할을 수행함을 입증하였습니다. 흥미롭게도, ULS는 KRIT1 mRNA 발현을 증가시키는 반면, 세포 용해액 내 KRIT1 단백질 수준은 감소했습니다.

KRIT1이 HEG1과 결합할 수 있으며, 앞선 실험에서 ULS가 HEG1 단백질의 배지 내 방출을 유도함을 고려할 때, 연구진은 KRIT1 역시 HEG1과 함께 분비되는지를 검토했습니다. 그 결과, ULS 조건에서 KRIT1 또한 배지로 방출되었으며, HEG1 Knockdown은 KRIT1의 방출을 차단할 수 있습니다. 이는 KRIT1의 방출이 HEG1에 의존하는 것을 의미합니다.

HEG1 Knockout은 동맥경화를 악화시킵니다

내피세포을 타겟팅하는 HEG1 결손이 마우스 동맥경화 진행에 미치는 영향을 평가하기 위해, 연구진은 HEG1^fl/+ 마우스(Cyagen 제공)를 이용하여 타목시펜 유도형 내피세포 특이적 HEG1 Knockout(KO) 마우스(HEG1^iECKO)를 구축했습니다. 급성 PCL 모델에서 HEG1^iECKO 마우스는 경동맥 플라크 면적이 40% 증가하였으며, 플라크 내 괴사 핵의 확대, 대식세포 침윤 증가, 섬유성 캡의 박화 및 플라크 내 출혈과 같은 특징을 보였습니다(그림 3).

그림 2. 내피세포 특이적 HEG1 Knockout은 진행성 동맥경화 플라크 형성을 촉진합니다.

Western diet로 유도한 동맥경화 모델에서도 HEG1^iECKO 마우스는 HEG1^WT 마우스에 비해 플라크 수가 유의하게 증가하였으며, 이는 성별 및 대동맥 부위 의존적인 양상을 보였습니다. 특히 대동맥궁에서는 암수 모두에서 플라크 수가 증가한 반면, 하행 대동맥 및 대동맥동 부위에서는 수컷에서만 플라크 형성이 증가했습니다. 이는 내피세포 HEG1 결손의 친동맥경화 효과가 대동맥 부위 및 성별에 따라 차이를 보임을 시사합니다.

마지막으로 연구진은 HEG1 발현 수준과 인간 관상동맥 내 동맥경화 플라크의 중증도 간의 상관관계를 분석했습니다. 비병변 단계(I–II 단계)의 관상동맥 내피세포에서는 HEG1 발현이 풍부하게 관찰된 반면, 진행된 병변(III–IV 단계 및 V–VI 단계)의 내피세포에서는 HEG1 단백질 발현이 현저히 감소하했습니다(그림 3). 이러한 결과는 HEG1 발현 감소가 인간 관상동맥의 진행성 동맥경화와 밀접하게 연관되어 있음을 보여주며, HEG1의 임상적 중요성을 부각시킵니다.

그림 3. 진행성 플라크를 동반한 인간 관상동맥에서 HEG1 발현은 현저히 감소합니다.

결론

종합하면, 상기 연구는 HEG1이 새로운 항동맥경화 혈류 민감 단백질임을 입증했습니다. HEG1은 KRIT1과의 상호작용을 통해 MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2–KLF2/4 경로를 조절함으로써 내피세포 항상성을 유지하고 동맥경화의 진행을 억제합니다(그림 3). 이러한 혈류 의존적 HEG1–KRIT1–MEKK3–MEK5–ERK5–MEF2–KLF2/4 신호 경로는 향후 항동맥경화 치료 전략 개발을 위한 새로운 치료 타겟으로서 중요한 가능성을 제시합니다.

자료 출처

Tamargo IA, Baek KI, et al. HEG1 Protects Against Atherosclerosis by Regulating Stable Flow-Induced KLF2/4 Expression in Endothelial Cells. Circulation. 2024 Apr 9;149(15):1183-1201. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.064735.