베타 지아스모시아 연구: Hbb-bs 및 Hbb-bt 이중 결손(DKO) 마우스 모델
HBB 유전자 변이의 병리적 영향
헤모글로빈(Hb)은 적혈구 내에서 신체 전반에 산소를 운반하는 역할을 하는 단백질입니다. 그 구조는 주로 두 개의 알파-글로빈 서브유닛과 두 개의 베타-글로빈 서브유닛으로 구성되어 있습니다. 각 서브유닛은 헤모글로빈 분자의 중심에 헤모(heme) 분자를 포함하고 있으며, 헤모는 철 이온과 결합할 수 있어 헤모글로빈이 산소를 운반할 수 있게 합니다.
정상 성인에서는 베타-글로빈 사슬이 HBB 유전자에 의해 코딩됩니다. 성인 헤모글로빈(HbA)은 두 개의 베타-글로빈 사슬과 두 개의 알파-글로빈 사슬(각각 HBA1 또는 HBA2 유전자에 의해 코딩됨)로 구성되며, 전체 헤모글로빈의 약 97%를 차지합니다.[2] 베타 지아라세미아 환자에서는 HBB 유전자에 발생한 변이로 인해 베타-글로빈 사슬의 합성이 감소하거나 완전히 부재하게 되어 헤모글로빈 수치가 낮아지고, 적혈구 생성 이상, 조기 적혈구 파괴, 빈혈 등의 질환을 유발합니다.
베타 지아라세미아의 임상 유형
베타 지아라세미아는 베타-글로빈 유전자(HBB)에 발생한 변이로 인해 기능성 헤모글로빈(Hb) 서브유닛 베타(베타 글로빈 사슬)의 양적 감소 또는 완전한 부재를 초래하는 유전성 혈액질환으로, 임상적으로 β-thalassemia intermedia 및 β-thalassemia major로 알려져 있습니다. β-thalassemia minor(또는 β-thalassemia trait)를 가진 환자는 HBB 유전자에 변이를 동반한 이형접합체이며, 일반적으로 무증상이거나 경미한 빈혈을 보입니다. 이는 중증 임상 증상인 β-thalassemia intermedia 및 β-thalassemia major를 유발하기 위해 동형접합 또는 복합 이형접합이 필요합니다.[3] 헤모글로빈병과 달리, 지아라세미아는 헤모글로빈의 구조적 이상이 아니라 헤모글로빈 합성에 영향을 미칩니다. 베타-글로빈의 부족은 알파-글로빈 사슬의 과잉을 초래하여 질환의 발병에 기여합니다.
β-지아라세미아의 분자 병리학
(즉, 알파 글로빈 사슬 대 베타 글로빈 사슬의 비율). 비균형한 알파/비-알파 글로빈 사슬 합성으로 인해 미결합된 알파 글로빈 사슬이 포함체 형태로 침전되며, 이는 골수 및 비장의 적혈구 전구세포를 손상시키고 비효율적 적혈구 생성을 유도합니다. 현재까지 약 350개의 병리적 변이형이 보고되었으며(http://globin.cse.psu.edu), β-사슬 출력 감소 정도에 따라 기능적으로 분류됩니다:
- β0-지아라세미아 변이형(헤모글로빈 서브유닛 베타 합성의 완전한 부재): 무의미한 변이, 프레임시프트 변이 또는(때때로) 스플라이싱 변이에 의해 발생
- β+-지아라세미아 변이형(베타 글로빈 사슬 출력 감소): 인트론, 프로모터 영역(CACCC 또는 TATA 박스), 폴리아데닐레이션 신호, 5' 또는 3' 비번역 영역, 또는 스플라이싱 이상에 기인한 병리적 변이
- β++-지아라세미아 변이형(베타 사슬 합성의 최소한의 결핍): 매우 경미하여 때때로 '침묵형'으로 간주되며, 운반자는 명백한 혈액학적 증상을 보이지 않을 수 있음
특히 β0 및 β+ 변이형과 관련된 임상적 중증도는 다양하며, α-지아라세미아 관련 병리적 변이형이 HBA1 또는 HBA2 유전자에 동반 유전된 경우와 같이 완화되는 유전적 요인이 존재할 경우 수정될 수 있습니다. 이는 알파 글로빈 발현을 감소시켜 알파/비-알파 글로빈 사슬의 불균형을 완화하기 때문입니다.[3]
이제 각 유형의 β-지아라세미아에 대한 유전자형-표현형 상관관계를 자세히 살펴보겠습니다.
β-지아라세미아 주요형
중증 베타 지아라세미아(Beta-Thalassemia Major) 환자는 두 개의 결함이 있는 베타-글로빈 변이형을 지니며, 동형접합 돌연변이로 인해 베타-글로빈 사슬 합성이 완전하거나 거의 완전히 부재하게 되어 다음과 같은 질환 증상이 나타납니다. 돌연변이는 HbA 합성 감소 또는 부재를 초래하며, 이는 베타-글로빈 사슬을 포함합니다. 베타-글로빈 사슬의 부재는 알파-글로빈 대 비-알파-글로빈 사슬 합성 비율의 불균형을 초래하여 알파-글로빈 사슬의 상대적 과잉을 유도합니다. 과잉된 알파-글로빈 사슬은 적혈구 내에서 포함체를 형성하여 적혈구막에 산화 손상을 유발하고, 적혈구 파괴 및 골수 내 비효율적 적혈구 생성을 초래합니다.
β-지아라세미아 중간형
중간형 베타 지아라세미아(β-Thalassemia Intermedia) 환자는 β+ 지아라세미아의 특정 이형접합 돌연변이와 특정 동형접합 돌연변이를 지닌 비정형 지아라세미아를 가질 수 있으며, 또는 두 가지 다른 헤모글로빈 생산 장애의 복합 이형접합 상태일 수 있습니다. 그 병리생리학적 변화는 중증형과 경증형 사이에 위치합니다.
β-지아라세미아 경증형
경증 베타 지아라세미아(Beta-Thalassemia Minor) 환자는 하나의 비정상적인 베타 글로빈 유전자를 지니며, 이로 인해 이형접합 운반자 상태가 되고 베타-글로빈 사슬 합성에 약간의 감소가 발생합니다. β+ 침묵형 변이형은 일정한 잔여 베타 글로빈 사슬 출력을 동반하며, 정상적인 적혈구 지표와 정상 또는 경계선 수준의 HbA2를 보입니다. 이형접합 β+ 변이형은 β-지아라세미아 중간형 또는 경증형과 관련될 수 있습니다. 병리학적 증상은 빈혈의 경미한 형태를 포함할 수 있으나, 때때로 무증상일 수 있습니다.[3]
Hbb 유전자 편집 모델의 구축
C57BL/6 마우스는 마우스 염색체 7에 인접해 위치한 매우 유사한 두 개의 성인 베타-글로빈 단백질 코딩 유전자인 Hbb-bs와 Hbb-bt를 가지고 있으며, 각각 세 개의 엑손으로 구성되어 있습니다.[4-5] 베타 지아라세미아 질병 연구를 위한 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스 모델은 유전자 편집 기술을 활용하여 C57BL/6J 마우스에서 Hbb-bs 및 Hbb-bt 유전자를 동시에 Knockout(KO)함으로써 구축되었습니다. 이 이중 녹아웃(DKO) 모델은 동형접합 치명적이며, 이형접합 마우스는 중증 베타 지아라세미아의 전형적인 표현형 특징을 보입니다. 이는 헤모글로빈 함량, 적혈구 수, 적혈구 용적률, 평균 적혈구 헤모글로빈 농도, 적혈구 분포 폭, 혈소판 수, 비장 크기, 적혈구 형태 등에서 이상이 나타나지만 생식 능력은 유지합니다. 따라서 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스는 베타 지아라세미아 및 잠재적 치료제에 대한 전임상 연구를 위한 유망한 플랫폼입니다.
Hbb-bs&Hbb-bt DKO 모델의 검증 데이터
Hbb-bs&Hbb-bt DKO 모델의 검증 데이터
그림 1. 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스와 야생형(WT) 마우스의 체중 변화 곡선
남성 및 여성 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스 모두 야생형(WT) 마우스와 비교하여 비교적 일관된 성장 상태를 보입니다.
(2) 생존 곡선
그림 2. 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스와 야생형(WT) 마우스의 생존 곡선
남성 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스는 13주차부터 사망률이 증가하기 시작하였으며, 여성 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스는 15주차부터 사망률이 나타나기 시작하였습니다.
(3) 전혈계 검사
그림 3. 14주龄 남성 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스와 야생형(WT) 마우스의 전혈계 검사 결과
전혈계 검사 결과에 따르면, 야생형 마우스와 비교하여 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스는 적혈구 수(RBC), 헤모글로빈 함량(HGB), 적혈구 용적률(HCT)이 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC)는 약간 감소하였으며, 적혈구 분포 폭(RDW)과 혈소판 수(PLT)는 유의미하게 증가하였습니다. 이러한 파라미터의 변화는 유사한 유전적 변이 유형에 의해 유발된 베타 지아라세미아의 임상 표현형과 유사합니다.
(4) 혈액 도말 분석
그림 4. 14주龄 남성 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스와 C57BL/J 야생형 마우스의 혈액 도말 분석 결과
혈액 도말 분석 결과에 따르면, 이형접합 Hbb-bs&Hbb-bt DKO 마우스는 핵을 가진 세포 비율이 증가하였으며, 적혈구의 중심 희미 부위가 확장되고, 더 많은 비정형 및 파편화된 적혈구, 핵을 가진 적혈구가 관찰되었습니다. 외부 혈액에서 다양한 비정형 적혈구 형태가 존재하며, 목표세포(노란 화살표 표시), 가시세포(빨간 화살표), 눈물방울세포(초록 화살표), 파편화된 세포(파란 화살표)가 포함됩니다. 반면, C57BL/J 야생형 마우스의 적혈구는 구조적으로 완전하며, 두굴림 디스크 형태를 보이며 심각한 이상이 없습니다.
Cyagen 혈액질환 관련 모델
베타 지아라세미아 외에도, Cyagen은 다양한 혈액질환, 특히 희귀 혈액질환에 대한 전임상 혈액학 연구를 위한 유전자 변형 모델을 개발하였습니다. 이에는 유전자 녹아웃, 유전자 침입, 포인트 변이 등이 포함됩니다. 또한 연구자의 요구에 따라 맞춤형 또는 공동 개발 모델도 제공할 수 있습니다.
| 표적 유전자 | 관련 질환 | 제품 번호 | 제품명 |
| F8 | 혈우병 A | C001211 | F8 KO |
| F9 | 혈우병 B | C001509 | F9 KO |
| Hbb | 베타 지아라세미아(HBB) | C001508 | Hbb-bs&Hbb-bt DKO |
| Flvcr1 | 선천성 비정형 적혈구 생성 장애 | S-CKO-06994 | C57BL/6J-Flvcr1em1Cflox/Cya |
| Flvcr1 | 선천성 비정형 적혈구 생성 장애 | S-KO-06025 | C57BL/6J-Flvcr1em1C/Cya |
| Usp1 | 판코니 아나미아 | S-CKO-07336 | C57BL/6J-Usp1em1Cflox/Cya |
| Usp1 | 판코니 아나미아 | S-KO-06331 | C57BL/6J-Usp1em1C/Cya |
참고문헌:
[1]Galanello R, Origa R. Beta-thalassemia. Orphanet J Rare Dis. 2010 May 21;5:11.
[2]Hardison RC. Evolution of hemoglobin and its genes. Cold Spring Harb Perspect Med. 2012 Dec 1;2(12):a011627.
[3]Langer AL. Beta-Thalassemia. 2000 Sep 28 [Updated 2024 Feb 8]. In: Adam MP, Feldman J, Mirzaa GM, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2024. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1426/
[4]Zhang F, Zhang B, Wang Y, Jiang R, Liu J, Wei Y, Gao X, Zhu Y, Wang X, Sun M, Kang J, Liu Y, You G, Wei D, Xin J, Bao J, Wang M, Gu Y, Wang Z, Ye J, Guo S, Huang H, Sun Q. An extra-erythrocyte role of haemoglobin body in chondrocyte hypoxia adaption. Nature. 2023 Oct;622(7984):834-841.
[5]Trimborn T, Gribnau J, Grosveld F, Fraser P. Mechanisms of developmental control of transcription in the murine alpha- and beta-globin loci. Genes Dev. 1999 Jan 1;13(1):112-24.
