AI + Minigene, 이상 대안 스플라이싱 연구를 어떻게 돕는가

대체 스플라이싱은 전령 RNA 전구체(pre-mRNA) 내 스플라이스 부위의 다양한 조합을 선택하여 가변적으로 스플라이싱된 mRNA를 생성하는 조절 과정입니다. 이러한 다수의 mRNA는 서열과 활성이 다른 단백질을 코딩할 수 있지만 모두 단일 유전자에서 유래됩니다.

대체 스플라이싱의 조절에는 많은 상호작용 성분이 관여하며, 스플라이소솜 단백질 유전자의 특정 서열(시스 작용 요소)의 영향을 받습니다. 단일 염기 돌연변이와 같은 작은 변화도 비정상적인 대체 스플라이싱을 유발할 수 있으며, 이는 뒤셀 근이영양증(DMD), 척수성 근위축증(SMA) 등 다양한 질병의 발병과 관련이 있습니다.

여기서 사이아젠은 임상 샘플 검사 과정에서 대체 스플라이싱과 관련될 수 있는 돌연변이 부위를 검증하는 방법을 공유하고자 합니다. 과학적 검증을 수행하기 전에 대체 스플라이싱의 가능한 병원성 부위를 효율적이고 정확하게 스크리닝하는 가장 빠른 방법을 알아보십시오.

이상 대체 스플라이싱은 왜 발생합니까?

대체 스플라이싱은 스플라이싱을 조절하는 단백질과 인트론 및 엑손에 존재하는 시스 작용 요소의 상호작용으로 발생합니다. 여기에는 인트론 스플라이싱 인핸서(ISE), 인트론 스플라이싱 사일런서(ISE), 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE), 엑손 스플라이싱 사일런서(ESS), Ag-엑손-GT 보존 서열이 포함됩니다. 시스 작용 요소와 해당 단백질의 조합이 엑손 스플라이싱의 정확성과 효율성을 조절합니다. 또한 스플라이싱 조절 단백질의 발현에는 시공간 특이성이 존재하는 경향이 있습니다(즉, 발달 단계와 조직 부위에 따라 동일한 조절 단백질의 발현 패턴에 차이가 있음). 이는 다른 스플라이싱 유형을 생성하는 데 기여할 수 있습니다.

이러한 시스 작용 요소의 서열이 돌연변이(즉, 점 돌연변이)되면 다양한 이상 스플라이싱이 발생할 수 있습니다. 일반적인 이상 스플라이싱 유형에는 엑손 전체 또는 일부 결실, 인트론 전체 또는 일부 잔류, 다중 엑손 결실 등이 있습니다. 이상 스플라이싱의 결과는 엑손의 부분 서열이 결실되어 단백질이 긴 아미노산 서열을 잃게 되는 것입니다. 또한 3의 배수가 아닌 삽입 또는 결실로 인해 발생하기도 하며, 이는 프레임시프트 돌연변이나 조기 종결 신호 생성을 유발하여 결국 정상적인 단백질 기능이 소실됩니다.

대체 스플라이싱은 어떻게 검증합니까?

대체 스플라이싱 검증

시퀀싱을 통해 많은 SNP 돌연변이 부위에 접근할 수 있습니다. 일부 부위는 유전자의 비코딩 영역(인트론, 프로모터, 유전자간 스페이서 등)에 위치하고 일부는 인트론과 엑손 접합부 근처에 위치합니다. 이러한 부위를 선택하여 생물정보학 분석을 수행하여 최종적으로 대체 스플라이싱과 관련된 가능한 돌연변이 부위를 스크리닝할 수 있습니다.

기존 생물정보학 예측 툴은 고전적인 스플라이싱 모델을 사용하여 스크리닝하지만 대체 스플라이싱의 메커니즘은 더 복잡합니다. 따라서 기존 생물정보학 예측 툴의 알고리즘은 실제 스플라이싱 상황을 정확하게 시뮬레이션할 수 없어 많은 병원성 부위를 놓치게 됩니다.

AI 기반 대체 스플라이싱 예측 툴

기존 생물정보학 분석과 AI 모델을 결합하여 검증 실험에 들어가기 전에 관심 있는 유전자좌를 스크리닝할 수 있습니다. RDDC RNA 스플라이싱 툴은 심층 신경망(DNN) 전략과 생물정보학을 기반으로 단백질 코딩 번역에 더 큰 영향을 미치는 스플라이싱 이상을 분석하여 스플라이싱을 예측하고, 결국 염기 돌연변이 수준에서 유전 질환의 원인을 찾아냅니다. RNA 스플라이싱 툴을 사용할 때는 관심 유전자, 전사체 ID, 돌연변이 부위 위치, 돌연변이 유형만 입력하면 예측 결과를 얻을 수 있습니다.

미니진 시스템이 가설 검증을 지원

가설을 검증하는 일반적인 방법은 점 돌연변이 세포주를 구축하여 세포 표현형 분석과 cDNA 검출을 수행하는 것입니다. 하지만 돌연변이 부위 수가 많을 경우 점 돌연변이 세포를 구축하는 데 시간과 비용이 많이 소모됩니다. 효과적인 미니진 시스템을 활용하여 검증하면 성공률이 크게 향상됩니다.

미니진 스플라이싱 분석은 돌연변이 또는 야생형 부위를 포함하는 엑손과 측면 인트론을 시험관 내에서 벡터에 클로닝한 다음, 벡터를 세포에 형질감염시킨 후 RT-PCR 및 시퀀싱으로 스플라이싱을 분석하는 과정을 포함합니다. 일반적인 메커니즘은 클로닝 부위에 연구 대상 외인성 엑손과 측면 인트론을 삽입할 수 있고, 클로닝 부위의 상류와 하류에 각각 벡터 유래 엑손 A와 B가 존재하는 것입니다. 이후 검출을 위해 엑손 A와 B 서열을 기반으로 RT-PCR용 증폭 프라이머를 설계합니다. 구축된 벡터를 세포에 형질감염시키면 야생형 그룹은 엑손 A + 외인성 엑손 + 엑손 B를 포함하는 mRNA를 발현합니다. RT-PCR과 시퀀싱으로 유전자형을 확인합니다. 돌연변이 그룹에서 비정상적인 대체 스플라이싱이 발생하면 야생형과 일치하지 않는 mRNA가 발현됩니다.

그림 1. 스플라이싱 리포터 미니진 분석을 사용하여 스플라이싱에 미치는 영향 평가

미니진의 응용

미니진은 이상 스플라이싱 연구에 널리 사용되고 있습니다. 가족 분석 및 시퀀싱을 포함한 일부 유전 연구(그림 2)는 EYS에 유전성 망막 변성과 관련될 수 있는 돌연변이 부위가 있음을 밝혔습니다. 생물정보학 분석을 통해 대체 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있는 두 가지 돌연변이 부위 c.3877 + 1g > A와 c.2992_2992+6delinsTG이 발견되었습니다.

다음으로 연구자들은 미니진 시스템을 사용하여 예측 결과를 검증했습니다. 첫 번째 부위 c.3877 + 1g > A의 경우 인트론 24, 엑손 25, 인트론 25를 pspl3 벡터에 삽입하고 ARPE-19 세포주에 형질감염시켰습니다. RT-PCR 증폭과 시퀀싱을 통해 이 부위가 비정상적인 대체 스플라이싱을 유발할 수 있음을 확인했습니다(그림 3).

다른 부위도 동일한 방법으로 검증했습니다. 인트론 18, 엑손 19, 인트론 19를 pSPL3 벡터에 삽입하고 각각 HEK293T와 ARPE-19 세포주에 형질감염시켰습니다. RT-PCR 증폭과 시퀀싱을 통해 이 부위가 비정상적인 대체 스플라이싱을 유발할 수 있음을 확인했습니다(그림 3).

그림 2. 색소성 망막염과 관련될 수 있는 EYS 변이

그림 3. 미니진 시스템이 이상 대체 스플라이싱 발생을 검증

요약

비정상적인 mRNA 스플라이싱은 다양한 질병의 발병과 밀접하게 관련되어 있습니다. 관련 약물 개발을 지원하기 위해서는 그 메커니즘, 특히 가능한 병원성 부위를 효율적이고 정확하게 스크리닝하고 효과적인 과학적 검증을 수행하는 방법을 심층적으로 탐구해야 합니다.

사이아젠은 강력한 생물정보학 데이터베이스를 보유하고 있어 인간 유전자와 유전 질환, 동물 모델, 세포주 모델에 대한 전장 유전체 분석을 수행할 수 있습니다. 모든 가용 데이터와 머신러닝 및 심층 신경망(DNN)에 대한 전문 지식을 결합하여 인공지능(AI)을 사용하여 모델 선택 및 설계를 새로운 시대로 이끌어가는 것을 목표로 합니다.

더 중요한 것은 점 돌연변이 세포 모델과 마우스 모델을 통해 돌연변이 부위의 이상 스플라이싱 메커니즘을 실험실에서 확인할 수 있으며, 이는 ASO 치료제 개발에 도움이 된다는 점입니다. 이 과정에서 미니진 시스템을 사용하여 치료 효과가 있는 ASO 약물을 효율적으로 스크리닝할 수도 있습니다.

참고문헌

[1] Westin, Ida Maria et al. “EYS mutations and implementation of minigene assay for variant classification in EYS-associated retinitis pigmentosa in northern Sweden.” Scientific reports vol. 11,1 7696. 8 Apr. 2021,

[2] Gaildrat, Pascaline et al. “Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) vol. 653 (2010): 249-57.