CAR-T 개발에서의 흐름 세포 측정법 응용
차이머릭 항원 수용체 T세포(CAR-T) 면역요법은 유전자 공학 기술을 활용하여 자가 또는 동종의 T세포를 종양 특이 항원을 표적하는 새로운 살해세포로 변환하며, 혈액암 치료에서 놀라운 성과를 거두고 있습니다. CAR-T 세포 면역요법의 전임상 연구는 약물 개발 과정에서 핵심적이고 장기간 소요되는 단계로, 타겟 발견, 항체 개발, 단일 사슬 가변형(scFv) 스크리닝, CAR-T 세포 구축, CAR-T 세포의 체외 항종양 활성 평가, CAR-T 세포의 체내 항종양 활성 평가 등이 포함됩니다.
유세포 분석법은 유체에 분산된 미세 입자를 계수하고 분류할 수 있는 기술입니다. 높은 효율성, 간편성 및 정확성 덕분에 CAR-T 세포 치료 전반에 걸쳐 널리 사용되고 있습니다. 이제 유세포 분석법이 CAR-T의 전임상 개발에 어떻게 적용되는지 살펴보겠습니다.
1. 타겟 항원 발현 검출
CAR-T 세포는 종양세포 표면의 항원에 대한 scFv를 정확히 인식하고 살해 역할을 수행하므로, 이상적인 타겟 항원을 선별하는 것은 중요한 단계입니다. 높은 특이성을 가진 타겟 항원을 선택하기 위해, 모든 세포에서 타겟 항원의 발현 양을 검출하고, 종양세포에서는 고발현되지만 정상세포에서는 발현되지 않거나 낮은 발현을 보이는 항원을 선별해야 하며, 이를 통해 CAR-T 세포 치료의 독성 부작용을 최소화할 수 있습니다. 유세포 분석법은 이 과정에서 중요한 응용을 합니다. 예를 들어, 다음 보고서에서는 저자가 유세포 분석법을 통해 타겟 항원인 B세포 성숙 항원(BCMA)의 분포를 검출하였습니다. 그 결과, BCMA는 정상 및 종양성 플라즈마세포(PCs)에서 고발현되었지만, 정상 조직에서는 발현되지 않거나 낮은 발현을 보였습니다.
2. 바이러스 티터 검출
CAR-T의 임상 개발 전에, 이후 CAR-T 세포의 항종양 능력 평가를 위해 CAR-T 세포와 항원 과발현을 갖는 종양세포 모델을 구축해야 합니다. 일반적으로, 상기 안정적인 세포 모델은 타겟 서열을 인코딩할 수 있는 렌티바이러스로 해당 세포주를 감염시킴으로써 효율적으로 구축할 수 있습니다. 이 과정에서 렌티바이러스의 티터는 엄격히 통제되어야 합니다. 유세포 분석법은 렌티바이러스 활성의 티터를 검출하는 중요한 수단 중 하나입니다. 아래는 유세포 분석법이 렌티바이러스 티터 검출에 어떻게 적용되는지 설명하는 예시입니다.
CD19 렌티바이러스 티터의 유세포 분석법 검출
CD19 항원 렌티바이러스의 티터를 검출하기 위해, 사전에 배양된 293T 세포에 CD19 항원을 인코딩할 수 있는 정제된 렌티바이러스를 0.01, 0.1, 1, 10 μl의 네 가지 농도로 첨가합니다. 72시간 후 293T 세포를 유세포 분석법으로 분석하여 CD19 항원 양성률(즉, 렌티바이러스에 감염된 293T 세포 수가 총 세포 수에 대한 비율)을 검출하고, 다음 공식에 따라 전도 티터를 계산합니다:
그림과 같이, 전도된 바이러스 농도가 증가함에 따라 CD19 항원 양성 세포 수가 점차 증가함을 알 수 있으며, 이는 렌티바이러스가 우수한 감염 활성을 지닌다는 것을 의미합니다. 위 공식에 따라 바이러스 티터를 계산한 결과 1.4×108 Tu/ml로 산출되었습니다.
비슷하게, FMC63 CAR 렌티바이러스 티터도 동일한 방법으로 검출되었으며, 계산된 바이러스 티터는 약 4.33×108 Tu/ml였습니다.
3. CAR-T 세포 표현형 및 CAR 양성률 분석 (또는 과발현 항원 세포 모델의 항원 양성률)
구축된 CAR-T 세포의 경우, 기능 검증 전에 표현형과 CAR 분자 감염 양성률을 검사해야 합니다. 유세포 분석법은 CAR-T 세포 표면의 마커 단백질과 전체 세포에서의 CAR 분자 양성률을 효과적으로 검출할 수 있습니다. 마찬가지로, 항원 과발현 세포 모델의 경우 항원 발현도 유세포 분석법을 통해 검출할 수 있습니다. 아래에서는 유세포 분석법이 CAR-T 세포 표현형 및 세포 양성률 검사에 어떻게 적용되는지 실제 사례를 통해 설명합니다.
▶ T세포 표현형 및 CD19 CAR-T 세포 양성률 검출
두 가지 방법으로 준비한 T세포의 표현형을 항체를 이용해 분석한 결과, 두 방법 모두 고순도의 T세포를 확보할 수 있었지만, 두 방법으로 증폭된 T세포 하위형의 비율은 상당히 다릅니다. Method1으로 증폭된 T세포는 주로 CD8+T세포 하위형이었으며, Method2는 CD8+T세포와 CD4+T세포 비율의 차이가 작은 T세포 집단을 증폭할 수 있었습니다. 이는 T세포 하위형의 역할에 대한 견고한 기반을 마련합니다.
동시에, Method1로 증폭한 T세포에 CD19 CAR 렌티바이러스를 전도하여 CD19 CAR-T 세포를 구축하였으며, 유세포 분석법을 통해 CAR 단백질 발현 효율을 검출하였습니다. 그 결과, CD19 CAR-T 세포의 양성률은 45.59%에 달하였으며, 이는 CD19 CAR-T 세포를 성공적으로 구축했다는 것을 의미합니다.
A:
B:
그림 4. T세포 표현형 분석 및 FMC63 CAR-T 세포 양성률 검출.
A. PBMC 활성화 및 확대 10일차의 T세포 비율 및 표현형 분석 결과.
B. FMC63 CAR-T 세포의 CAR 양성률 검출 결과. (자료 출처: Cyagen)
▶ 품질관리용 CD19-293T 세포주 구축
CD19 렌티바이러스로 293T 세포를 감염시켜 CD19를 안정적으로 발현하는 293T 세포주를 구축하였으며, 유세포 분석법을 통해 항원 CD19의 고발현을 검출하였습니다.
4. CD19 CAR-T 세포의 체외 살해 효과 검출
CAR-T 세포를 종양세포 또는 항원 과발현 세포 모델과 혼합하여 후자의 사멸률을 검출하면, CAR-T 세포의 살해 효과를 반영할 수 있습니다. 그 중 종양세포의 조기사멸은 유세포 분석법으로 검출할 수 있습니다. 아래 예시와 같이:
CD19 CAR-T 세포와 T세포를 다양한 효과-타겟 비율로 Nalm6 세포와 공배양한 후 48시간 후 종양세포의 조기사멸을 유세포 분석법으로 검출하였습니다. 그림과 같이, T세포 그룹(대조군)과 비교하여 CD19 CAR-T 세포는 다양한 효과-타겟 비율 조건에서 Nalm6 세포에 대해 유의미하게 향상된 특이적 세포독성 효과를 보였습니다. 동시에 세포 배양 상층액에서의 사이토카인 함량 검출 결과도, 종양세포와 공배양 후 CD19 CAR-T 세포의 IFN-γ 분비가 T세포보다 유의미하게 증가함을 보여주었습니다.
A:
B:
C:
그림 6. CD19 CAR-T 세포가 Nalm6 종양세포를 살해하는 결과.
A. Nalm6 세포 표면의 CD19 항원 양성률 검출 결과;
B-C. FMC63 CAR-T 세포가 Nalm6 종양세포를 살해하는 결과 및 상층액 사이토카인 검출 실험 결과. (자료 출처: Cyagen)
5. 체내에서 CAR-T 세포의 치료 효과 모니터링
CAR-T 세포의 표현형과 살해 효과를 체외에서 검증한 후, 체내 실험을 수행할 수 있습니다. CAR-T 세포를 종양 마우스 모델(예: NSG, C-NKG, NOG 등)에 주사한 후, 다양한 일수의 외혈(PB) 샘플을 채취하여 유세포 분석법으로 CAR-T 세포의 증식 활성, 세포 표현형, 살해 능력을 모니터링할 수 있습니다.
6. 결론
CAR-T 치료는 종양 치료 분야에서 가장 유망한 기술 중 하나이며, 암을 "치료할 수 있는" 치료법으로, 고도의 림프종 및 백혈병을 제거할 수 있는 능력을 보여주고 있습니다. 그 전임상 연구는 여러 중요한 단계를 거쳐야 하며, 각 단계는 엄격한 품질 관리 기준이 필요합니다. 유세포 분석법은 이미 자신의 장점과 특성을 제공하고 있지만, 최근 몇 년간 관련 기술의 지속적인 발전과 함께, CAR-T 세포 치료 연구 및 개발 전반에 걸쳐 더욱 널리 사용될 것입니다.
Cyagen의 종합 솔루션은 종양 면역세포 치료의 전임상 연구를 촉진합니다
CAR-T 및 기타 세포 치료의 전임상 연구에서 세포 모델 및 동물 모델의 선택은 매우 중요합니다. 연구 목적을 명확히 하고 효과적인 실험 모델과 연구 프로토콜을 수립하면 연구의 효율성이 높아집니다. Cyagen은 항체 스크리닝부터 안정주 구축, 세포/동물 모델 구축, 약리동학 평가에 이르기까지 세포 치료의 종합 서비스를 제공하여, CAR-T 및 기타 세포 치료의 연구 개발 과정을 더욱 가속화할 수 있습니다. 자세한 정보가 필요하시면 문의해 주세요.
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참고문헌
Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018;9(40):25764-25780.
