원위 이식 모델의 동적 모니터링이 어렵나요? 상관없습니다. 생체 이미징 기술이 나올 거예요!

실험 데이터를 얻기 위해 동물을 조를 나누어 죽이는 전통적인 방법과 비교했을 때 생체 이미징 기술은 세포 및 분자 수준의 정성적, 정량적 연구를 통해 관찰하고 기록합니다. 원위 종양 형성 CDX 모형 관련 연구 과정 중 질병 경과 및 종양 전이를 편리하게 추적하기 위해 종양 모형의 동적 모니터링은 과거에 비해 제한적이지 않습니다.

Cyagen은 면역력 저하 생쥐에 200종 이상의 인체 세포계를 성공적으로 이식했습니다. 이는 피하, 정동맥, 원위 등 접종 부위를 포함하며, 원위 이식 측면에서 폐암, 대장암, 간암 등 많은 암 종류의 성공적인 사례가 있습니다. PE lumina III 작은 동물 생체 이미징 등 고감도 장비 지원을 기반으로 CAR-T 등 세포 요법 약력학 실험을 진행할 수 있으며 원위 종양 모형 성장 및 형광 나노 약물의 체내 분포 등을 감지할 수 있습니다.

생체 이미지 기술에 관하여

종양 생체 이미징에 일반적으로 사용되는 광학 표기 방법에는 다음이 포함됩니다.

• 반딧루시페린 (Firefly Luciferase) 또는 형광 단백질을 보고 유전자로 사용하여 유전자 변형 기술 체외 종양 표기 종양 세포를 표기해 종양의 발전 변화를 직접 관찰하거나 특정 유전자를 표기하여 종양 관련 유전자가 종양 발전 과정 중의 역할을 연구합니다.
• 기능성 형광 프로브를 외인성 주사하여 종양 발전 과정 중 분자 사건을 관찰한 후 종양의 발전 변화를 반영합니다.

종양 연구에서 생체 이미징의 적용

거시적으로 보면 종양 연구에 작은 동물 생체 광학 이미지 기술을 적용하는 것은 주로 다음에 집중되어 있습니다.

• 종양 성장 및 전이의 장기 모니터링.
• 항종양 약물 연구 개발.
• 암의 분자 메커니즘 연구.

약력학 외에도 해당 기술은 약물의 체내 표적화, 분포 및 대사 연구에도 널리 사용됩니다. 이러한 응용은 약물을 직접 관찰 대상으로 하며 일반적으로 형광 프로브를 사용하여 약물 자체를 직접 표기하고 형광 신호를 추적하여 체내 약물 분포를 반영합니다. 예를 들어, 항체 혹은 폴리펩티드류 약물이 종양을 효과적으로 표적화할 수 있는지 여부를 연구할 때 혐광 염료를 사용하여 화학 결합의 결합을 통해 표적 항체 또는 폴리펩티드를 표기하고 생체 광학 이미징을 사용하여 위에서 언급한 표기 대상의 종양 표적화를 관찰할 수 있습니다.

생체 형광 이미지 기술을 적용한 약물 분포 관찰은 현재 주로 생물 고분자 약물 연구에 국한되어 있으며, 천연 또는 화학 미세분자 약물의 분포 대사 연구는 주로 방사선 핵종 표기 이미징(PET 또는 SPECT)에 의존하는데 그 이유는 상대적으로 고분자량의 형광 염료로 미세분자 약물을 표기하면 형광 염료 자체가 체내 미세분자 약물의 분포 대사에 영향을 미치므로 생체 형광 이미징 기술을 이러한 연구에 적용할 수 없기 때문입니다.

체내외 생물 발광 실험 정리

작은 동물의 생체 이미징에 일반적으로 사용되는 두 가지 기술은 생물 발광과 형광이며 그 중 생물 발광은 루시페라아제 유전자로 세포 혹은 DNA를 표기하고 생성된 프로테아제를 사용하여 상응하는 기질 플루오레세린과 반응하여 광신호를 생성합니다.

체외 생물 발광

생물 발광 실험 플루오레세인 시약 조제: 플루오레세인 나트륨염으로 100mM의 저장 용액(200×, 농도 30mg/ml)을 제조하며 실험 요구에 따라 구성할 수도 있습니다. D-Lucirerin을 예열된 조직 배양기에 용해시켜 150㎍/ml 농도의 작업 용액을 제조합니다. 저장 용액을 조직 배양기를 사용하여 1:200로 희석하고 작업 용액(최종 농도 150μg/mL)을 구성합니다.

세포를 배양하는 배양기를 제거합니다. 세포 수를 세고 세포 농도를 100,000 세포/ml(10,000 세포/100μl)로 조정합니다. 이미지 분석 전, 세포 배양 플레이트에 1x 플루오레세인 작업 용액을 추가한 다음 이미지 분석을 진행합니다.

*참고: 이미징 전, 37°C에서 짧은 시간 동안 세포를 배양하면 신호를 강화시킬 수 있습니다.

체내 생물 발광

생물 발광 시험 플루오레세인 시약의 제조: D-플루오레세인 칼륨염 작업 용액(15mg/mL)을 멸균 PBS로 제조하고 0.2um 여과막으로 여과하여 멸균합니다. 10uL/g의 용량에 따라 150mg/kg의 플루오레세인 작업 용액(예를 들어, 10g의 생쥐에 100μl 작업 용액을 투여하여 1.5mg의 플루오레세인을 투여함)을 투여하고 복강 내 플루오레세인을 주사하여 10-15분 후 이미징을 진행합니다.

복강 내 주사: 왼손으로 동물을 고정시키고 복부를 위로 향하게 하며 동물의 정수리(두부) 끝을 아래로 향하게 합니다. 생쥐를 2~3회 부드럽게 흔들어 장내 소화되지 않은 음식을 아랫배의 4분의 1부위까지 이동시켜 공동을 형성합니다. 주입 부분은 75% 에탄올로 소독합니다. 오른손으로 주사기를 들고 생쥐의 복부에 삽입합니다. 주사 부위는 생쥐의 뒷다리 근부 연결 부분 중 한쪽에서 1.5cm 떨어진 부분으로 45도 정도로 천천히 주사하고 주사 깊이는 1cm 미만입니다. 주사를 넣는 느낌은 국부적인 피부 함몰이 사라지고 텅 빈 것 같은 느낌입니다.

생쥐 생체 이미징 실험 요점

털이 있는 생쥐의 경우 이미징 실험 전 날 제모하는 것을 제안합니다. 이렇게 하면 모발의 배경 형광과 기타 간섭을 최소화할 수 있습니다. 생쥐의 모발은 단파장 여기 분광의 배경 형광이 특히 두드러지는데 그림1의 두 ICR 생쥐(백모) 중 왼쪽은 제모한 생쥐이고 오른쪽은 제모하지 않은 생쥐입니다. 465Nm의 빛이 여기될 때 모발의 배경 형광을 명확하게 확인할 수 있습니다. 제모 크림은 배경 형광을 유발할 수 있는 방향 성분을 함유하고 있고 제모 크림과 황화나트륨 등 화학 시약은 생쥐 피부에 화상을 일으켜 상처 부위에 때때로 강한 배경 형광을 유발하기 때문에 생쥐 면도기를 사용하는 것을 제안드립니다.

그림1

생쥐는 이미징 전 미지근한 물에 적신 거즈로 입, 코, 발톱, 배뇨 부위를 닦는 것이 좋습니다. 왜냐하면 이러한 부위에는 필요없는 배경 형광이 있기 때문입니다. 형광 분광을 분리할 때 신호가 비교적 약하고 식별하기 어려운 경우가 있으며 그림2에 따라 실험 설계를 할 수 있습니다. 즉, 대조군 생쥐, 수용체 생쥐, 양성 염료 대조군을을 설정할 수 있습니다.

그림2

생체 이미징 잡음 문제

샘플의 배경광

즉, 재료에는 인광 발광 물질이 포함되어 있는데 문제 재료에는 플라스틱, 안료, 유기물, 플라스틱 로프 및 일부 플라스틱 용기가 포함되며 동물의 소변을 포함한 일부 오염 물질도 인 광원일 수 있습니다.

샘플에서 오는 배경광

즉, 샘플의 천연 방출 광은 샘플이 감지해야 하는 신호가 아닙니다. 세포 배양기는 인광을 생성할 수 있으며(재료 사용 전 이미징 스캔을 진행하여 문제 있는 물질을 식별하고 제거해야 합니다) 이러한 자가 방출 광은 항상 생체 동물(자발적 생물 발광)을 동반하고 생체 내 생물 발광 이미징의 주요 검출 영역에 존재합니다. 대부분의 동물은 비교적 낮은 수준의 자발적 생물 발광으로 나타나며 일반적으로 약한 신호를 고감도로 감지할 때만 문제가 존재합니다.

배경 근사치(비슷한 대조군 동물을 검사 및 측정하거나 생쥐의 비 검사/측정 영역을 검사 및 측정하여 획득)는 ROI 측정에서 제거할 수 있습니다.

체내 적용의 경우 파장 범위가 600nm 이상인 것이 가장 좋으며 600nm 미만의 빛은 동물 조직에 쉽게 흡수되어 빛의 침투 깊이에 영향을 미칩니다. 예를 들어 몇 밀리미터 이상 깊이의 형광 그룹은 여기되지 않을 수 있습니다. 또한 600nm 미만의 파장에서는 조직의 자발적 형광이 증가됩니다.