전통적 유전자 타겟팅을 통한 녹아웃 마우스 개발 방법
첫 번째 Knockout(KO) 쥐가 만들어진 이후 과학자들은 매우 큰 발전을 이뤘습니다. 타겟 유전자 편집 기술은 오늘날 유전자 녹아웃 과학자들이 주로 사용하는 방법으로 빠르게 자리 잡았으며, 이는 해당 방법의 짧은 소요 기간 때문입니다. 이 영상에서 설명하는 전통적인 배아 줄기세포(ES Cell, ESC) 기반 기술은 주로 프로젝트 완료까지 소요되는 시간이 길기 때문에(8~12개월) 이제는 과거의 기술이 되었습니다. 이 영상에서는 다루지 않았지만, Cyagen의 독점적인 TurboKnockout™ 유전자 타겟팅 서비스는 전통적인 배아 줄기세포(ESC) 매개 타겟팅 기술을 기반으로 하며, C57BL/6 또는 BALB/c 쥐 모델을 단 6개월 만에 제공할 수 있습니다.
전통적인 ESC 매개 유전자 녹아웃 쥐를 생성하는 데 사용되는 개발 과정에 대해 알아보기 위해 저희 최신 영상을 시청해 주세요. 이 쥐 모델은 다양한 유전적 및 인간 질병 연구에 활용되고 있습니다.
영상: Knockout 쥐란 무엇인가요?
참고: 이 영상에서 언급된 백분율은 정확한 값이 아니므로 신뢰도를 높이기 위해 주의 깊게 고려해야 합니다. 예를 들어, 벡터의 타겟팅 효율은 위치에 따라, 그리고 벡터 간에 매우 다릅니다. 10%는 단지 대략적인 평균 타겟팅 효율일 뿐입니다.
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최초의 Knockout 쥐를 확립하는 과정
1981년 마틴 J. 에반스 박사는 쥐에서 배아 줄기세포를 배양하는 데 성공하였으며, 이는 유전자 편집이 가능한 살아있는 쥐를 생산하는 데 기여하였습니다. 이러한 발전을 바탕으로 마리오 카페키와 올리버 스미시는 특정 유전자가 비활성화된 살아있는 쥐를 번식시켜 1989년 최초의 Knockout(KO) 쥐 모델을 확립하였습니다. 궁극적으로 카페키, 스미시, 에반스는 최초의 기록된 Knockout 쥐를 개발한 공로로 2007년 노벨상을 수상하였습니다.
Knockout 쥐를 생성하기 위한 전통적인 유전자 타겟팅 방법
Knockout 쥐를 생성하는 방법은 여러 가지가 있지만, 이 영상에서는 원래의 Knockout 쥐 모델을 개발하는 데 사용된 전통적인 유전자 타겟팅 방법에 대해 설명하겠습니다. 전통적인 유전자 타겟팅은 배아 줄기세포를 사용하며, 일반적으로 ‘ES 세포’ 또는 ‘ESC’로 약칭됩니다.
이 모델은 C57BL/6 쥐의 배아 줄기세포에서 시작됩니다. 수정 후 약 4일 후 배아의 배아낭(Blastocyst)이 형성되며, 주로 두 가지 유형의 세포로 구성됩니다. 하나는 외부 세포인 타로포블라스트, 다른 하나는 내부 세포 질량으로 알려진 배아낭입니다. 배아낭에서 세포가 실제로 분리되면 배아 줄기세포라고 불립니다. 먼저, 배아낭에서 세포를 추출합니다(이 경우 검은 쥐 배아에서 추출), 특수한 줄기세포 배지에 배양하여 분리하고 복제를 허용합니다. 배아에서 분리된 세포는 배아 줄기세포라고 불립니다.
타겟 벡터의 설계 및 삽입
연구자들은 특정 DNA 구조물을 포함한 벡터를 설계하며, 이는 자연적으로 존재하는 유전자 대신 네오마이신 인산전이효소(neor) 유전자를 포함하도록 수정됩니다. 네오마이신 인산전이효소(neor)는 네오마이신이라는 일반적인 항생제에 대한 세포 저항성을 유도하는 단백질을 코드하는 유전자입니다. 그러나 이 유전자가 동일한 유전자 서열을 가진 배아 줄기세포 게놈 내에 동형 재조합을 통해 완전히 통합된 경우에만 작동합니다.
전기천공을 통한 전이
과학자들은 전기천공기(electroporator)라는 기계를 사용하여 고전압 전자기장을 적용하여 배아 줄기세포의 인지질 이중층 막에 구멍을 만듭니다. 이를 통해 neor 유전자를 포함한 벡터가 세포 손상을 입히지 않고 배아 줄기세포 내부로 들어갈 수 있습니다. 전기천공은 매우 비효율적이므로, 실제로 벡터를 세포벽을 넘어서 통합하는 세포는 매우 적습니다.
동형 재조합을 통한 캐시트 교환
이제 벡터가 배아 줄기세포에 전기천공으로 도입되었으므로, 동형 재조합이 일어나면서 세포는 네오마이신 저항성을 획득할 수 있으며 동시에 전체 유전자 녹아웃을 수행할 기회를 갖게 됩니다. 동형 재조합은 유사하거나 동일한 DNA 분자 간에 유전 정보를 교환하는 과정으로, 감수분열의 제1단계인 전기단계에서 발생합니다. 이 경우, 관심 유전자 외에도 벡터 게놈에서 유사한 엑손 두 개가 존재합니다. 이러한 유사성 덕분에 해당 위치에서 재조합이 가능해집니다.
동형 재조합의 효율성
동형 재조합은 100% 효율적인 것은 아닙니다. 따라서 모든 과정이 끝난 후, 일부 세포는 유전자를 부분적으로 녹아웃한 상태일 수 있고, 일부는 유전자 녹아웃에 실패한 상태일 수 있으며, 일부는 관심 유전자 상류 및 하류에 네오마이신 저항 유전자가 재조합된 상태일 수 있으며, 일부는 관심 유전자를 완전히 녹아웃하고 네오마이신 저항 유전자로 대체한 상태일 수 있습니다.
완전한 녹아웃 유전자를 포함한 세포 식별
이 시점에서 일부 세포는 유전자 녹아웃을 성공적으로 완료했고, 일부는 완료하지 못한 상태입니다. 과학자들이 어느 세포가 녹아웃을 완료했는지, 어느 세포가 완료하지 못했는지를 판단해야 합니다. 네오마이신을 포함한 배지에서 세포를 배양하면, 네오마이신 저항성을 가진 세포와 전기천공 과정에서 실패하거나 부분적으로 재조합된 세포를 구분할 수 있으며, 후자 세포는 사멸됩니다.
남은 세포 중 약 90%는 저항 유전자가 목표 유전자 상류 또는 하류에 무작위로 통합된 상태이며, 나머지 10%는 완전한 녹아웃을 가진 상태입니다. 과학자들은 PCR과 서던 블롯 분석을 수행하여 어느 세포가 녹아웃을 포함하고 있는지 확인해야 합니다.
채임(Founder) 쥐의 생성
이제 유전자 편집된 배아 줄기세포는 배지에서 제거되어 수정된 쥐 배아의 배아낭 단계에서 마이크로 인젝션을 통해 주입됩니다. 중요한 점은 이 배아낭이 두 마리의 야생형 흰 쥐가 교배하여 생성된 것입니다. 이 대체 모체로부터 태어난 다색의 후손은 채임이라고 불리며, 또한 팔로우 쥐(Founder mouse)라고도 합니다. 이들은 서로 다른 유전적 프로파일을 가진 두 개의 다른 생물체에서 유래한 세포로 구성되어 있습니다. 이 쥐의 검은 털을 구성하는 세포는 Knockout에 대해 이형접합인 ES 세포에서 유래한 것이며, 채임의 흰 털은 야생형 알레르에 대해 동형접합인 세포를 나타냅니다.
팔로우 쥐를 교배하여 이형접합 및 동형접합 Knockout 쥐 생성
이러한 채임 동물은 흰 쥐와 교배되며, 후손은 완전히 검은 색 또는 완전히 흰 색이 됩니다. 완전히 검은 색인 동물은 비모자이크 이형접합 후손(non mosaic heterozygous progeny)이라고 하며, F1 쥐라고도 합니다. 이들은 유전자 녹아웃이 발현되기 위해 동형접합이 되어야 합니다. 동형 재조합은 유사하거나 동일한 DNA 분자 간에 유전 정보를 교환하는 과정으로, 감수분열의 제1단계인 전기단계에서 발생합니다.
동형접합 쥐를 얻기 위해서는 두 마리의 F1 쥐를 서로 교배해야 합니다. 단순한 펜넷 사각형(Punnett square)을 사용하면 두 이형접합 쥐의 후손을 예측할 수 있습니다. 네 마리 중 한 마리가 Knockout에 대해 동형접합 우성이며, 따라서 네 마리 중 한 마리가 완전히 Knockout 표현형을 나타냅니다. PCR과 DNA 염기서열 분석을 통해 과학자들은 어느 쥐가 동형접합 우성인지, 어느 쥐가 여전히 이형접합인지 구분할 수 있습니다.
연구용 바로 사용 가능한 Knockout 쥐 모델
Cyagen Knockout 카탈로그 모델 레포지터리가 설립된 이후, 전 세계 연구자들에게 최소 3개월 만에 바로 사용 가능한 이형접합 유전자 녹아웃(KO) 쥐를 제공해 왔습니다. 이러한 표준 제공 외에도, 인기 있는 수요에 부응하여 동형접합 번식 서비스를 제공하기 시작하였습니다.
동형접합 Knockout(KO) 라인은 유전자 KO의 표현형 효과에 대한 명확한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 발달 생물학에서 매우 중요한 영역인 배아 발생에 필수적인 유전자를 식별하는 데에도 도움이 될 수 있습니다. 당연히 많은 연구자들이 동형접합 라인이 배아 발생에 영향을 줄 수 있다는 우려를 가지고 있습니다. 이형접합 및 동형접합 KO 라인을 함께 사용하면 인간 발달 장애를 평가하는 데 가장 효과적인 도구를 제공하며, 새로운 진단 및 치료 접근법에 대한 연구를 크게 촉진할 수 있습니다.
Cyagen Knockout 카탈로그 모델에 대한 무료 동형접합 번식 서비스
2022년 5월 31일까지 Knockout 카탈로그 모델을 주문하시면 무료로 동형접합 제공물로 업그레이드받을 수 있습니다. 이는 $3,450 가치의 혜택입니다. 견적 요청 시 프로모션 코드 "HOMO22"를 기재해 주세요.
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