유도형 Cre 마우스를 활용한 췌장 유전자 녹아웃 개선
Cre-Lox 시스템은 특정 세포/조직에서 타겟 유전자 편집을 가능하게 하며, 그 발현 시기는 프로모터에 의해 결정됩니다. 시간과 공간 모두에서 유전자 발현을 이중으로 제어하기 위해 리간드 의존성 CreER 재조합효소가 개발되었습니다. CreER은 에스트로겐 수용체의 호르몬 결합 도메인과 결합된 Cre 재조합효소로 구성되어 있습니다. 에스트로겐 유사체인 타모크시펜이 부재할 경우, 재조합효소는 주로 세포질에 존재합니다. 타모크시펜이 작용할 때만 재조합효소가 세포핵으로 들어가 재조합 기능을 발휘합니다. CreERT2는 에스트로겐 결합 도메인에 세 개의 점 돌연변이(G400V/M543A/L544A)를 가진 CreER 재조합효소의 개선형으로, 유도되지 않았을 때 배경 활성이 감소하고 타모크시펜에 대한 감도 및 유도 효율이 향상됩니다. 오늘날, Cyagen은 개선된 췌장 특이적 Cre 드라이버 마우스 라인 — Pdx1-CreERT2 마우스 모델 (제품 번호: C001537)을 소개합니다.
PDX1 유전자: 췌장 기관 형성 및 β세포 기능의 핵심
PDX1 유전자는 췌장 기관 형성, β세포 성숙 및 유지, 정상 인슐린 기능을 주로 조절하는 단백질을 코딩합니다. PDX1 유전자의 활성화는 인슐린 분비 및 β세포 내 중요한 유전자의 발현을 촉진하며, 췌장 줄기세포가 췌장 β세포로 분화하는 데 필수적입니다. 따라서 PDX1은 당뇨병의 유전자 또는 대체 요법의 중요한 타겟입니다.[1]
연구에 따르면, PDX1 단백질은 α세포의 분화를 억제함으로써 β세포의 특성과 기능을 유지하며, PDX1이 부재할 경우 췌장 β세포는 생존할 수 있고 β세포에서 α세포로의 재프로그래밍이 가능합니다.[2] PDX1은 초기 췌장 상피에서 특이적으로 발현되며, 발달 과정 중 세포 증식과 분화에 관여합니다. 성체 단계에서는 β세포의 호르몬 생성에 필수적입니다. PDX1은 췌장 발달 초기에 가장 먼저 발현되는 전사 인자 중 하나이며, β세포 성숙 과정 동안에도 지속적으로 발현됩니다.[1,3] β세포와 일부 δ세포 외에도, 발달 과정 중 소장 및 중추신경계에서도 발현됩니다.[4-5]
타겟 췌장 연구를 위한 Pdx1-CreERT2 마우스 모델
Cyagen은 유전자 편집 기술을 활용하여 독자적으로 Pdx1-CreERT2 마우스(제품 번호: C001537)를 개발하여, 유전자 연구 및 전임상 연구에 있어 우수한 시간적 제어력을 제공하는 간 특이적 Cre 드라이버 마우스 라인을 제공합니다. Pdx1-CreERT2 마우스 모델은 마우스 Pdx1 유전자 조절 요소에 의해 CreERT2 재조합효소가 발현됩니다. Pdx1-CreERT2 마우스가 loxP 사이트를 포함한 마우스와 교배되면, 타모크시펜 유도를 통해 자손의 췌장에서 Cre 재조합효소에 의해 loxP 사이트 간의 재조합이 유도됩니다.
타모크시펜 유도를 통한 췌장 조직 특이적 유전자 재조합
타모크시펜 치료 없이 CreERT2 재조합효소는 주로 세포질에 존재합니다. 타모크시펜이 투여될 때만 CreERT2 재조합효소가 세포핵으로 들어가 재조합 활성을 발휘합니다. Pdx1-CreERT2 마우스가 loxP 사이트를 포함한 마우스와 교배되면, 타모크시펜 유도를 통해 자손의 췌장 세포에서 Cre 재조합효소에 의해 loxP 사이트 간의 서열 재조합이 유도됩니다. 중요한 점은, 타모크시펜 치료 없이도 유도 전에 CreERT2 재조합효소 발현이 약간의 누출이 발생할 수 있다는 것입니다. 이 균주에서 Cre 재조합효소 유전자 발현 캐스셋의 삽입 부위는 염색체 5에 위치하므로, 유전자 편집 마우스와 교배할 때 Cre 마우스와 동일한 염색체에 타겟 유전자가 있는 경우를 피해야 합니다.
Pdx1-CreERT2 마우스는 Pdx1-Cre 마우스보다 췌장 특이적 재조합 효율이 높다
Pdx1-CreERT2 마우스를 ROSA26-LSL-tdTomato 마우스와 교배한 후, 타모크시펜 또는 옥수수 기름으로 처리하여 CreERT2 재조합효소의 발현을 유도합니다. 형광 현미경 결과, 타모크시펜 처리군에서 췌장에 상당한 tdTomato 형광 신호가 관찰되어 높은 재조합 활성을 나타냅니다. 또한, 비유도성 Pdx1-Cre 마우스와 비교했을 때, Pdx1-CreERT2 마우스는 췌장에서 유의미하게 높은 재조합 효율을 보입니다.
Cre 재조합효소는 소장 및 흉선에서 제한된 발현을 보인다
Pdx1-CreERT2 마우스 모델은 우수한 조직 특이성을 나타낸다
요약
Pdx1-CreERT2 마우스 모델 (제품 번호: C001537)은 췌장에서 Cre 재조합효소의 고발현을 보였으며, 소장 및 흉선에서 관찰된 미미한 형광 신호는 미세한 재조합 사건을 시사합니다. 위, 자궁, 난소, 폐, 간, 뇌에서는 형광 현미경에서 재조합 신호가 검출되지 않아, 다른 주요 조직에 대한 타겟 외 발현이 없음을 나타냅니다. 따라서 Pdx1-CreERT2 마우스 모델은 췌장 이소렛 세포 조직에 대한 타겟 유전자 연구에 우수한 특이성을 보입니다.
참고문헌
[1] Ebrahim N, Shakirova K, Dashinimaev E. PDX1 is the cornerstone of pancreatic β-cell functions and identity. Front Mol Biosci. 2022 Dec 15;9:1091757.
[2] Gao T, McKenna B, Li C, Reichert M, Nguyen J, Singh T, Yang C, Pannikar A, Doliba N, Zhang T, Stoffers DA, Edlund H, Matschinsky F, Stein R, Stanger BZ. Pdx1 maintains β cell identity and function by repressing an α cell program. Cell Metab. 2014 Feb 4;19(2):259-71.
[3] Jennings RE, Berry AA, Kirkwood-Wilson R, Roberts NA, Hearn T, Salisbury RJ, Blaylock J, Piper Hanley K, Hanley NA. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 2013 Oct;62(10):3514-22.
[4] Ma J, Chen M, Wang J, Xia HH, Zhu S, Liang Y, Gu Q, Qiao L, Dai Y, Zou B, Li Z, Zhang Y, Lan H, Wong BC. Pancreatic duodenal homeobox-1 (PDX1) functions as a tumor suppressor in gastric cancer. Carcinogenesis. 2008 Jul;29(7):1327-33.
[5] Perez-Villamil B, Schwartz PT, Vallejo M. The pancreatic homeodomain transcription factor IDX1/IPF1 is expressed in neural cells during brain development. Endocrinology. 1999 Aug;140(8):3857-60.
