IECs가 MHC II 및 PD-L1을 활용하여 T세포 유도하는 방식

IECs에서 MHC II의 발현은 IEL의 분화에 필수적이다

DP IEL 분화 중 IECs의 비정형 APC 역할을 탐구하기 위해, 연구자들은 C57BL/6 생체형 마우스의 소장 다양한 부위에서 IECs의 MHC II 발현을 분석했습니다. 흐름 세포 측정 및 RNA-seq 실험을 통해 IECs의 DP IEL 분화에 대한 역할이 MHC II 항원 제시와 밀접하게 관련되어 있음을 확인했습니다. 또한, IECs에서 발현된 MHC II가 DP IEL 분화에 미치는 역할을 확인하기 위해, IECs에서 MHC II가 특정적으로 녹아웃된 마우스(MHC II△IEC)를 사용하여, IEL의 분화가 IECs에서 MHC II의 발현을 필요로 함을 입증했습니다. 이는 MHC II^fl/fl 대조군 마우스와 비교한 결과입니다(Figure 1G-H).

2. IECs에서 MHC II의 발현은 IFN-γ에 의존한다

비혈액세포(예: IECs)에서 IFN-γ가 MHC II의 발현을 강하게 유도할 수 있다는 보고가 있습니다. 이를 더욱 검증하기 위해, IFN-γ 수용체 녹아웃 마우스(IFN-γR^−/−)를 사용했습니다. 연구 결과는 이전 주장과 일치했습니다: IFN-γR^−/− 마우스의 IECs에서는 MHC II 발현이 검출되지 않았으며, DP IEL의 분화는 심각하게 억제되었고, SP T세포 내 비율은 거의 0에 가까웠습니다(Figure 2A). 생체형 마우스에서는 항-IFN-γ 항체를 투여한 후, MHC II 발현 수준과 SP IEL 세포 내 DP 비율이 유의미하게 감소했습니다(Figure 2B). 다른 보고에서도 IFN-γ이 DP IEL 분화에 필수적임이 밝혀졌으며, T-bet 전사인자 발현 유도를 통해 DP IEL 분화를 촉진함으로써, IFN-γ이 DP IEL의 기능적 성숙에 중요한 역할을 한다는 점이 확인되었습니다.

IECs에서 MHC II+가 DP IEL 분화에 비정형 역할을 하는지 직접 탐구하기 위해, IFN-γR^+/+ 마우스와 IFN-γR^−/− 마우스에서 유래한 소장 기관체를 구축했습니다. 먼저, IFN-γ가 기관체 내에서 생체 내와 동일한 효과를 발휘함을 확인했습니다. 즉, IFN-γ는 기관체 내 IECs에서 MHC II의 발현을 강하게 유도할 수 있었습니다(Figure 2D-E). 또한 다른 연구 결과는 T세포에서 발현되는 T박스(T-bet)가 DP IEL 분화 중 중요한 상류 조절자이며, Runx3 발현을 유도하고 ThPOK 발현을 억제함을 보여주었습니다. 장 미세환경 자극제와 함께, T-bet에 의해 유도된 사이토카인인 IFN-γ는 DP IEL 분화를 더욱 촉진할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 IFN-γ로 사전 자극한 소장 기관체와, anti-CD3ε/CD28로 24시간 사전 자극한 OVA 특이적 CD4+ T세포(OT-II)를 장 미세환경 자극제인 TGF-β와 비타민 A 유도체(RA)가 존재하는 조건에서 공배양했습니다(Figure 2F). 결과는 IFN-γ가 MHC II의 대량 발현을 유도하며, MHC II+IECs가 DP IEL 분화에 비정형 APC 역할을 하며, TGF-β와 RA 자극이 DP IEL 분화를 더욱 촉진함을 보여주었습니다.

3. IFN-γ에 의해 유도된 IECs의 PD-L1은 DP IEL 분화에 중요한 역할을 한다

이전 실험 결과는 MHC II+IECs가 CD4+IELs에 대한 동종 자극을 위한 APC 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 연구자들은 이들이 MHC II와 함께 조절하는 다른 공조수용체를 발현할 수도 있다고 추측했습니다. MHC II 발현이 IFN-γ에 의존하므로, 이 공조수용체는 IECs의 IFN-γ 신호와 관련이 있을 것이라 추측했습니다. 소장 기관체에 IFN-γ 처리 여부에 따라 RNA-seq 분석을 수행한 결과, PD-L1 단백질을 코딩하는 Cd274 유전자의 발현은 MHC II 관련 유전자와 유의미하게 상관관계가 있음을 밝혀냈습니다(Fig. 3A-B). 기관체 실험(Fig. 3C) 및 생체 내 실험(Fig. 3D-E) 모두에서 IFN-γ가 PD-L1 발현량에 유의미한 영향을 미친다는 것을 확인했습니다. DP IEL 분화에 IECs에서 PD-L1 발현이 필수적인지 추가로 검증하기 위해, PD-L1 녹아웃 마우스(PD-L1^−/−), 성숙한 T세포 및 B세포가 없는 RAG-1 녹아웃 마우스(RAG-1^−/−), IECs에서 PD-L1 타겟 유전자의 특정 녹아웃 마우스(PD-L1△IEC), 그리고 Cyagen이 구축한 PD-L1^fl/fl 대조군 마우스를 사용했습니다. 이러한 실험 결과(Fig. F-H)는 IECs에서의 PD-L1이 DP IEL 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

Figure 3A-B. 차이 발현 유전자 열화상도(A) 및 볼카노 플롯(B).

Figure 3C-E. (C) 다양한 농도의 IFN-γ 처리 후 소장 기관체에서 PD-L1 발현량; (D) IFN-γR^−/− 마우스에서 IFN-γR^+/+ 마우스에 비해 PD-L1 발현량이 유의미하게 감소함; (E) IFN-γR^+/+ 마우스에 항-IFN-γ 항체 투여 후 IECs에서 PD-L1 발현량이 유의미하게 감소함.

Figure 3F-H. (F) PD-L1^+/+ 마우스에 비해 PD-L1^−/− 마우스의 소장에서 DP IEL 비율이 유의미하게 감소함; (G) RAG-1−/− 마우스에 비장 CD4+ T세포를 주입한 후, anti–PD-1 치료로 DP IEL 발달이 억제됨; (H) PD-L1^fl/fl 마우스에 비해 PD-L1^△IEC 마우스의 소장에서 DP IEL 비율이 유의미하게 감소함.

4. 소장에서 MHC II 및 PD-L1의 발현과 DP IEL의 분화에 있어 미생물군집이 필수적이다

소장에서 IFN-γ 생성과 IECs에서 MHC II 발현이 미생물군집의 존재를 필요로 한다는 보고가 있습니다. 따라서 IECs에서 PD-L1 발현이 미생물군집에 의해 조절되는지 여부를 탐구하기 위해, 무균(GF) 마우스와 특정 병원체가 없는(SPF) 마우스를 사용했습니다. 실험 결과에 따르면, 미생물군집에 의해 유도된 IFN-γ는 IECs에서 MHC II 및 PD-L1 발현을 자극하며, 이 두 가지는 모두 DP IEL 분화 조절에 기여할 수 있습니다.

Figure 4A. SPF 마우스에 비해 GF 마우스의 소장에서 IECs에서 PD-L1 발현 수준이 유의미하게 감소했으며, MHC II 발현량과 DP IEL 비율은 소장의 다양한 부위에서 유의미하게 감소했으며, 특히 소장 말단에서 두드러졌습니다.

Figure 4B. 항생제 치료 후 SPF 마우스의 소장에서 IECs에서 PD-L1 발현 수준이 유의미하게 감소했으며, MHC II 발현량과 DP IEL 비율은 소장의 다양한 부위에서 유의미하게 감소했으며, 특히 소장 말단에서 두드러졌습니다.

Figure 4C. 면역형광 실험 결과, SPF 마우스의 소장 말단에서 대부분의 IECs가 MHC II를 발현하였으며, 약 20%는 PD-L1을 발현했지만, GF 마우스에서는 MHC II 및 PD-L1 발현이 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다.

5. PD-1 신호는 ThPOK 발현 억제를 통해 DP IEL의 분화를 촉진한다

전형적인 CD4+ T세포와 CD8+ T세포는 각각 T세포 유도 POZ/Krüppel 유사 인자(ThPOK)와 runt 관련 전사인자 3(Runx3)를 발현함으로써 자신의 계통을 유지합니다. 따라서 DP IEL의 분화는 Runx3 발현의 상승과 ThPOK의 제거를 필요로 합니다. 또한, IECs에서 MHC II 및 PD-L1 발현은 DP IEL 분화에 필수적이며, 이는 TCR 및 PD-1 신호가 CD4+ IECs의 세포 재프로그래밍에 관여할 수 있음을 시사합니다. 이전 실험 결과는 T세포의 내재적 PD-1 신호가 DP IEL 분화에 필수적임을 보여주었습니다(Fig. 5A-C). 이를 더 깊이 탐구하기 위해, ThPOK-GFP 보고자 마우스를 사용했습니다. 실험 결과는 PD-1이 ThPOK 발현 억제와 DP IEL 분화를 위해 PD-1 신호의 존재가 필요함을 보여주었습니다(Figure 5D-E). 또한, 체외 실험 결과(Figure 5G-I)는 PD-1 신호가 전형적인 Src 동형 도메인을 포함하는 타이로신 인산화효소(SHP) 경로를 통해 CD4+IECs에서 ThPOK 발현을 억제함으로써 DP IEL 분화를 촉진함을 보여주었습니다.

Figure 5A-C. (A) C57BL/6 생체형 마우스에서 다양한 IEL 하위군에서 PD-1 발현. SP IEL이 DP IEL로 분화할 때 PD-1 발현이 감소함. (B) PD-L1+/+ 마우스에 비해 PD-L1−/− 마우스의 소장에서 DP IEL 비율이 유의미하게 감소함. (C) PD-L1+/+ 및 PD-L1−/− 마우스의 비장 CD4+ T세포를 1:1 혼합하여 RAG-1−/− 수용자 마우스에 이식한 결과, PD-L1−/− CD4+ T세포에서 DP IEL 비율이 유의미하게 감소함.

Figure 5D-F. (D) 실험도. ThPOK-GFP 보고자 마우스의 비장 T세포를 RAG-1−/− 수용자 마우스에 이식하고 재구성 기간 동안 항-PD-1 항체 치료를 실시함. (E) ThPOK 및 Runx3 발현 수준. (F) DP IEL 비율.

Figure 5 G-I. (G) CD4+ T세포, TGF-β, RA, PD-L1을 3일간 공배양한 후 ThPOKhi 세포 비율을 측정함. PD-L1은 ThPOK 발현 억제를 매개함. (I-H) CD4+ T세포, TGF-β, RA, PD-L1 및 SHP 억제제(SHPi)를 3일간 공배양한 후 DP IEL 비율 및 ThPOK, Runx3 발현 수준을 측정함.

결론

요약하면, 본 논문은 IECs가 소장 DP IEL 분화를 촉진하는 중요한 조절자이며, 비정형 APC 역할을 한다는 것을 입증했습니다. 소장 미생물군집이 생성하는 IFN-γ는 IECs에서 MHC II 및 PD-L1 발현을 자극하며, SP IELs에 TCR 자극과 공조수용체 신호를 제공함으로써 DP IEL로의 분화를 촉진합니다. 또한, 연구자들은 다양한 생리적 위치에서 IECs의 고유한 유전자 발현 프로파일이 주변 조직 거주 면역세포(예: DP IEL 분화)에 영향을 미칠 수 있음을 발견했습니다.

참고: 본문의 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경을 가집니다.

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참고문헌

Moon S , Park Y , Hyeon S , et al. Niche-specific MHC II and PD-L1 regulate CD4+CD8αα+ intraepithelial lymphocyte differentiation[J].
Journal of Experimental Medicine, 2021, 218 (4).DOI: 10.1084/jem.20201665