Knock down 할 것인가, Knock out 할 것인가?

유전자 기능 연구 방법 개요

유전자 기능의 미스터리를 풀 때 관심 유전자를 불활성화시킨 표현형만큼 중요한 단서는 없습니다. 다양한 방법이 존재하는 만큼 연구자들은 먼저 자신의 특정 과학적 질문과 실험 시스템에 가장 적합한 접근법이 무엇인지 결정해야 합니다.

10년 이상 동안 RNA 간섭 기반의 유전자 녹다운 방법(즉, RNAi & shRNA)은 유전자 기능에 대한 풍부한 통찰을 제공해왔지만, 최근 몇 년간 타겟 유전자 편집 및 TALEN 기반 방법의 등장으로 게놈 편집을 사용해 유전자 녹아웃의 효과를 빠르고 효율적으로 테스트할 수 있게 되었습니다. 여기서는 이러한 접근법들의 장단점을 검토하고, 주로 타겟 유전자 편집과 shRNA에 초점을 맞춰 어떤 실험 상황에서 한 접근법이 다른 접근법보다 더 나은지 설명합니다. 타겟 유전자 편집과 TALEN의 상대적 장점에 대한 논의는 이 주제에 대한 당사의 이전 뉴스레터(apac.cyagen.kr/community/newsletters/issue-1.html)를 참조하시기 바랍니다.

shRNA 녹다운

shRNA 녹다운이란?

이 방법에서는 세포에 도입된 벡터에서 헤어핀 구조를 형성하는 RNA가 발현됩니다. 이 RNA는 짧은(20-25nt) 이중 가닥 RNA 분자로 절단된 후 처리되어 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)에 통합되고, RISC는 표적 mRNA와 복합체를 형성하여 mRNA 분해 또는 번역 억제를 매개합니다. 최종 결과는 유전자 자체에는 어떠한 변화도 없이 유전자 발현이 하향 조절되는 것입니다. 항상 일정 비율의 기능적 mRNA가 세포 내에 남아 있기 때문에 유전자 기능이 완전히 제거되지는 않습니다.

장점

• 렌티바이러스 shRNA 벡터와 같은 높은 형질도입 효율을 가진 벡터 시스템을 사용하여 세포 집단을 처리할 수 있으며, 많은 연구에서 클로닝 과정 없이 직접 데이터를 얻을 수 있습니다.
• 많은 shRNA 벡터 시스템의 효율적인 형질도입과 높은 shRNA 발현 덕분에 shRNA 벡터를 사용한 실험은 일반적으로 규모 확장이 가능하고 반복 시 매우 일관성이 높습니다.
• 일시적 형질감염에 사용되는 일반 플라스미드 shRNA 벡터나 piggyBac 기반 shRNA 벡터와 같은 일부 벡터 시스템은 세포에서 제거될 수 있어 녹다운이 가역적입니다.

단점

• 기능적 mRNA가 남아 있기 때문에 유전자 기능이 완전히 소실되지 않습니다.
• 일반 플라스미드 형질감염과 같은 일부 벡터 시스템은 영구적인 녹다운을 매개하지 않고 일시적인 효과만 가집니다.

타겟 유전자 편집 녹아웃

타겟 유전자 편집 녹아웃이란?

이 방법에서는 게놈 내 18-22nt 표적 서열과 상동적인 가이드 RNA(gRNA)를 사용하여 공동 발현된 타겟 유전자 편집 뉴클레아제를 표적 부위로 유도합니다. gRNA의 혼성화로 타겟 유전자 편집이 국소화되고, 타겟 유전자 편집은 게놈의 표적 부위를 절단하여 이중 가닥 절단(DSB)을 생성합니다. 비상동 말단 연결 경로(NHEJ)에 의한 DSB의 세포 복구는 절단 부위에 확률적 오류를 생성합니다. 이는 일반적으로 작은 결실을 유발하고 더 드물게는 삽입 및 염기 치환을 유발합니다. 이러한 돌연변이가 단백질 코딩 영역을 파괴할 경우(예: 프레임시프트를 유발하는 결실) 기능적 유전자 녹아웃이 결과로 나타납니다.

장점

• 타겟 유전자 편집에 의해 도입된 게놈 변화는 영구적이고 안정적입니다.
• 일부 클론은 유전자의 모든 사본의 오픈 리딩 프레임에 프레임시프트나 조기 종결 코돈이 발생하여 유전자 기능이 완전히 소실됩니다.
• 다양한 gRNA가 타겟 유전자 편집을 유전자의 다른 부위로 표적화할 수 있어 절단형과 같은 다양한 정보성 돌연변이를 생성할 수 있습니다.

단점

• 도입된 돌연변이는 세포 집단 내에서 확률적이므로 개별 클론을 분리하고 평가하여(예: PCR 또는 시퀀싱을 통해) 각 클론의 돌연변이 특성을 확인해야 합니다.
• 대부분의 경우 세포에는 기능 상실 돌연변이가 없거나 이형 접합 돌연변이만 존재합니다. 경우에 따라 이것이 장점이 될 수도 있으며, 녹아웃 표현형을 해석하는 데 유용한 데이터를 제공할 수 있습니다.

Cyagen의 실험 솔루션

Cyagen Biosciences는 최근 모든 실험 요구에 맞춘 DNA 벡터의 맞춤 설계 및 클로닝을 위한 수상 경력이 있는 온라인 플랫폼인 VectorBuilder를 출시했습니다. VectorBuilder는 shRNA 및 타겟 유전자 편집 벡터 전체 라인 외에도 렌티바이러스, 아데노바이러스, AAV, piggyBac, 일반 플라스미드 등 다양한 벡터 시스템을 제공합니다. Cyagen Biosciences는 또한 맞춤형 바이러스 패키징 및 트랜스제닉, 녹아웃, 녹인 등을 포함한 마우스/랫 모델 생산 서비스도 제공합니다.