KO-First: 포유류 게놈 전반에서 유전자 기능을 연구하기 위한 도구
2000년대 초반부터 C57BL/6 마우스 ES 세포에서 리포터 태그가 부착된 널 돌연변이의 완전한 리소스를 생성하는 것을 목표로 대규모 녹아웃 컨소시엄이 설립되었습니다. 본 글에서는 국제마우스표현형컨소시엄(IMPC)이 주관하는 국제녹아웃마우스컨소시엄(IKMC) 사업의 일환으로 lacZ 태그가 부착된 조건부 대립유전자 생성의 기초가 되는 ‘knockout-first(KO-first)’ 조건부 대립유전자 전략에 대해 간략히 소개합니다. IMPC에서 사용하는 전략은 녹아웃 대립유전자를 생성하기 위한 상호 보완적인 특성을 가지고 있지만, 일반적으로 "모든 전사체 변이체에 공통적인 '핵심' 엑손을 식별하여 해당 엑손이 결실될 경우 유전자 기능이 파괴되도록 하는 방식에 의존합니다."1 본 글에서는 기능 유전체학과 단백체학을 규명하기 위한 KO-first 대립유전자 설계의 장점과 IMPC 프로그램의 일환으로 모든 단백질 코딩 유전자에서 lacZ 태그가 부착된 널 돌연변이를 생성하는 데 기여하는 바에 대해 논의합니다.
단백질 코딩 유전자의 기능 분석
인간과 마우스 게놈의 완전한 시퀀싱은 연구에 대한 통찰력을 제공했을 뿐만 아니라 유전자 기능에 대한 이해에 대한 추가적인 질문을 제기했습니다. 단백질 코딩 유전자의 완전한 기능 분석은 현재까지 유전학자들에게 중요한 목표이자 기술적 과제로 남아 있습니다. 유전자 기능을 해독하기 위한 초기 접근법에는 게놈 전체 수준의 돌연변이 유발 전략이나 마우스 배아줄기(ES) 세포에서의 유전자 트래핑 등이 포함됩니다. 유전자 트래핑은 마우스의 단백질 코딩 유전자의 절반 이상에서 무작위 삽입 돌연변이를 제공했지만, 이 기술은 유전자 트랩 대립유전자를 정밀하게 조작할 수 없다는 제한이 있어 완전한 유전자 녹아웃 세트를 생성하는 데 부적합합니다. IMPC는 수년간 타겟 유전자 편집 기술을 활용하여 녹아웃 유전자를 생성해 왔지만, 오프타겟 효과에 대한 우려가 증가하면서 도구의 정밀성을 검증하기 위한 철저한 유전자 시퀀싱 및 분석 없이 타겟 유전자 편집을 사용하는 것에 대한 의문이 제기되었습니다.
배아줄기(ES) 세포에서의 유전자 타겟팅은 정확성과 다용성으로 인해 유전자 변형 동물 모델을 만드는 주요 기술 중 하나로 남아 있습니다. ES 세포 기반 유전자 타겟팅은 완전한 표적 유전자를 보유함으로써 녹아웃과 조건부 적용 모두를 위한 다목적 대립유전자를 생성하는 KO-first 전략을 구축하는 데 사용되었습니다.
Knockout-first(KO-first) 조건부 대립유전자 전략의 장점
KO-first 전략은 마우스, 랫드, 인간 다능성 줄기세포를 포함한 많은 모델 시스템에서 기능 유전체학 및 단백체학에 의미를 가지며, 단백체 매핑을 위한 체계적인 게놈 규모 프로그램을 가능하게 하는 기능 유전체학 플랫폼 역할을 합니다. KO-first 대립유전자를 포함한 조건부 대립유전자는 발달 과정에서 조직 특이적 또는 시간적 방식으로 유전자 기능을 분석할 수 있게 합니다. KO-first 대립유전자는 구성적으로 발현되는 돌연변이의 한계를 극복하고, 부위 특이적 환화 재조합(Cre) 및 플리파제(FLP) 재조합 효소에 노출됨으로써(예: FLP 및 cre 마우스와 교배) 리포터 녹아웃, 조건부 녹아웃 및 널 대립유전자를 유연하게 생성할 수 있습니다. 또한 KO-first 대립유전자는 이중 재조합 매개 카세트 교환을 사용하여 ES 세포에서 쉽게 변형될 수 있습니다. 유전자 타겟팅의 발전과 함께 KO-first 대립유전자는 "조건부 돌연변이 유발을 통한 기능 연구를 위한 이중 타겟팅 ES 세포주의 체계적인 생성을 지원하며, 완전한 유전자 녹아웃을 제공함으로써 RNA 간섭 연구를 보완하고 확장하는 역할을 합니다." 적절한 cre 마우스와 교배함으로써 각 연구에 맞게 유전자의 시공간적 발현을 제어할 수 있으며, 필요에 따라 전신 녹아웃을 구현할 수도 있습니다. 이형 접합자 치사 표현형을 나타내는 유전자와 관련된 연구의 경우 FRT 플랭킹된 정지 카세트를 제거할 수 있는 기능이 추가적으로 유용합니다.3
KO-first 대립유전자의 다용성
IKMC 사업의 일환으로 EUCOMM 및 KOMP-CSD를 위한 KO-first 대립유전자 구축물을 생성하기 위해 프로모터 구동형 및 프로모터리스 타겟팅 카세트가 모두 사용됩니다. 초기 변형되지 않은 널 대립유전자(tm1a)는 "lacZ 트래핑 카세트 및 floxed 프로모터 구동형 neo 카세트를 유전자의 인트론에 삽입"함으로써 구현됩니다.1 FLP 재조합 효소에 의해 FRT 부위 사이의 유전자 트랩 카세트가 제거되면 돌연변이가 야생형으로 되돌아가 유전자 활성이 회복되고, 생성된 조건부 대립유전자(tm1c)에서 핵심 엑손 양쪽에 loxP 부위가 남게 됩니다. 조건부 대립유전자(tm1c)를 Cre에 노출시키면 핵심 엑손이 결실되어 프레임시프트 돌연변이(tm1d 대립유전자가 유도되고 돌연변이 전사체의 넌센스 매개 분해가 트리거되어 널 대립유전자를 회수할 수 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이 이 전략은 FLP를 사용하여 표현형을 되돌리고 Cre를 사용하여 표현형을 유도하는 것을 용이하게 하여 배양 ES 세포에서 발생할 수 있는 잠재적인 2차 연계 돌연변이를 평가할 수 있게 합니다. 또한 KO-first(tm1a) 대립유전자로 생성된 마우스를 적절한 Cre 드라이버 라인과 교배하여 선택 카세트를 제거하고 유전자 내의 주요 엑손을 제거함으로써 IMPC에 의한 표현형 분석을 위한 lacZ 태그 부착 대립유전자인 tm1b 널 대립유전자를 생성할 수 있습니다. KO-first 전략으로 가능한 대립유전자의 개요는 아래에 제공됩니다.
KO-first 대립유전자: 일반 돌연변이 정보
| 돌연변이 | 대립유전자 | 설명 | 조건부 활용 가능 여부 |
|---|---|---|---|
| tm1a | Knockout-First(KO-First) | 리포터 태그 부착 삽입 대립유전자 (Null) | Yes |
| tm1b | CRE 처리된 KO-First | 리포터 태그 부착 결실 대립유전자 (IMPC용) | No |
| tm1c | FLP 처리된 KO-First | 조건부 사용 준비 완료 (유전자 활성 회복) | Yes |
| tm1d | FLP 및 CRE 처리된 KO-First | 결실 대립유전자, 리포터 없음 (Null) | No |
표는 출처 2에서 각색되었습니다.
KO-first 조건부 대립유전자 전략 모식도
지난 4년간 사이아젠의 전문가들은 Nfe2l1, Tob1, Mir28a, Ccdc13, Tmem138, Mettl3 등 다양한 유전자에 대한 16개의 KO-first 마우스 모델 라인을 연구자들에게 제공했습니다.
사이아젠의 Ep300 KO-first 모델 관련 인용 논문
Zhou, P., Gu, F., Zhang, L., Akerberg, B. N., Ma, Q., Li, K., … Pu, W. T. (2017). Mapping cell type-specific transcriptional enhancers using high affinity, lineage-specific Ep300 bioChIP-seq. ELife, 6. doi: 10.7554/elife.22039
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참고 문헌
- Allele design - IMPC: International Mouse Phenotyping Consortium. (0AD). Retrieved September 26, 2019, from https://www.mousephenotype.org/understand/the-data/allele-design/.
- KOMP Allele Types. (0AD). Retrieved from https://www.komp.org/alleles.php.
- Skarnes, W. C., Rosen, B., West, A. P., Koutsourakis, M., Bushell, W., Iyer, V., … Bradley, A. (2011). A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature, 474(7351), 337–342. doi: 10.1038/nature10163
