Ldlr-E208X 마우스를 통한 FH 돌연변이 및 유전자 치료 검증
가족성 고콜레스테롤혈증(FH)은 저밀도지질단백질 콜레스테롤(LDL-C) 수치가 상승하고 조기 심혈관질환(CVD)이 발생하는 특징을 가진다. FH는 유전자 복제 효과를 보이는 자손성 우성 유전병으로, 저밀도지질단백질 수용체(LDLR), 아폴리포프로틴 B(APOB), 또는 시부틸리신 전환효소 9(PCSK9)를 코딩하는 유전자에서의 돌연변이에 의해 발생한다. 약 90%의 FH는 LDLR 돌연변이에 의해 발생한다. LDLR 돌연변이는 기능성 LDLR의 발현 수준을 감소시켜 간에서 LDL의 수용체 매개 청소 기능을 저하시키며, 이로 인해 순환혈액 내 과도한 LDL-C가 축적되어 동맥경화성 플라크의 발생과 축적을 초래한다. 동맥경화의 심각성은 간 조직 내 저밀도지질단백질 수용체(LDLRs)의 수준과 활성과 밀접하게 관련되어 있다.
가족성 고콜레스테롤혈증 – 연구 및 치료 전략
대부분의 국가에서 동형접합자 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH)의 유병률은 이전에 100만 명당 1명 미만으로 보고된 바 있다. HoFH는 유아 및 청소년기에 급속히 심각한 동맥경화 및 심혈관질환(CVD)으로 발전하여 조기 사망을 초래한다. 반면 이형접합자 FH(HeFH) 환자는 기능성 LDLR 단백질을 보유하고 있으므로, 현재의 FH 치료제(예: MG-CoA 환원효소 억제제[스테이틴])는 일반적으로 HeFH에 효과적이다. 특히 고강도 스테이틴과 PCSK9 억제제는 HoFH에 대해 제한적인 치료 효과를 보인다. 이러한 차이는 낮은 수준의 LDLR 발현과 활성도 FH의 발병 및 심각성에 중대한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
아데노 관련 바이러스(AAV)-타겟 유전자 편집-Pro 매개 유전자 치료
타겟 유전자 편집-Pro 시스템은 병적 돌연변이를 DNA 수준에서 수정할 수 있는 효과적인 유전자 편집 도구이며, 유전적 오류로 인한 인간 질환에 대한 유망한 치료법으로 주목받고 있다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 높은 안전성과 안정적인 장기적 발현 특성으로 인해 유전자 치료 응용 분야에서 가장 유망한 벡터로 평가되고 있다. 작성 시점 기준으로 AAV를 활용한 유전자 치료는 여러 해 동안 임상에서 사용되어 왔으며, AAV 매개 치료는 80개 이상의 질환에 대해 승인된 바 있다.
유전자 치료 사례 연구 – 가족성 고콜레스테롤혈증에서의 점 돌연변이 마우스
주빈 박사(중국과학원 상하이 생물화학 및 세포생물학 연구소) 및 Huang Hefeng 박사(상하이 교통대학교 국제평화산부인과소아병원) 연구팀은 Circulation 저널에 "체내 AAV-타겟 유전자 편집-Pro 매개 유전자 편집이 가족성 고콜레스테롤혈증에서의 동맥경화를 완화한다"는 제목의 논문을 공동 게재하였다.
이 연구에서 연구진은 아데노 관련 바이러스(AAV)를 통해 타겟 유전자 편집-Pro를 전달하여 Ldlr 유전자 수정을 달성하였으며, 이는 Ldlr 돌연변이 마우스에서 LDLR 발현을 부분적으로 회복시키고 동맥경화 증상을 효과적으로 완화하는 데 성공하였다. 무의미한 점 돌연변이 마우스 라인인 LdlrE208X는 가족성 고콜레스테롤혈증과 관련된 유전자 변이를 기반으로 하며, 희귀 질환 환자의 치료를 위한 잠재적 접근법을 제시한다(Zhao H, Li Y, et al., 2020, Circulation).
가족성 고콜레스테롤혈증 마우스 모델 구축
이 논문에서 저자는 가족성 고콜레스테롤혈증의 임상 동형접합자 환자들로부터 저밀도지질단백질 수용체(LDLR)의 새로운 미지의 돌연변이, 예를 들어 E207X를 선별하였다. 저자는 체외 세포 실험을 통해 돌연변이 LDLR 유전자의 발현이 이러한 기능적 변화와 관련이 있음을 검증하였다. 그렇다면 이러한 새로 발견된 점 돌연변이와 가족성 고콜레스테롤혈증 사이의 인과관계를 어떻게 확인할 수 있을까?
저자는 체외 실험 결과만으로는 설득력이 부족하다는 점을 인지하고, 인간 LDLR-E207X 점 돌연변이를 마우스에 복제하여 이 새로운 돌연변이와 질환 발생 간의 관계를 연구하였다. 저자들이 Cyagen에 LDLR-E207X 점 돌연변이 마우스 모델을 생성해 달라고 요청했을 때, 우리는 이 프로젝트에 놀라운 성과를 낼 수 있을 것임을 알았다. 인간 LDLR와 마우스 Ldlr 유전자 서열을 비교한 결과, 인간 LDLR의 E207X 점 돌연변이 부위는 마우스 Ldlr 유전자에서 E208X에 해당하는 것으로 확인되었다. 이를 바탕으로 타겟 유전자 편집-Pro 유전자 편집 기술을 활용하여 해당 Guide Molecule와 도너 DNA를 설계하였으며, 미세 난세포 주입을 통해 Ldlr-E208X 점 돌연변이 마우스 모델을 성공적으로 구축하였다. 결과적으로, 이 점 돌연변이에서 종결코돈의 도입으로 인해 LDLR 단백질 발현 기능이 손상되었으며, 고지방 식이요법을 제공받은 마우스 모델은 명확한 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화 증상을 보였다. Ldlr-E208X 점 돌연변이 마우스 모델은 Ldlr-E208X 점 돌연변이와 임상 환자에서의 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화 사이의 인과관계를 입증하였을 뿐만 아니라, 신뢰할 수 있는 가족성 고콜레스테롤혈증 마우스 모델을 구축하였다.
아데노 관련 바이러스(AAV)-타겟 유전자 편집-Pro 유전자 치료 적용
기술된 마우스 모델을 활용하여 저자는 질환에 대한 유전자 수정 치료의 가능성을 탐구하였다. 간 특이적 아데노 관련 바이러스 벡터 혈청형 8(AAV8) 매개 타겟 유전자 편집-Pro 유전자 치료 기술을 구현하기 위해, 간 특이적 발현 벡터인 AAV8-Cas9, AAV8 Guide Molecule, 그리고 정상 Ldlr 도너를 각각 구축하였다. 새로 태어난 Ldlr-E208X 점 돌연변이 마우스는 벡터의 피하 주사로 치료되었다. 결과적으로 AAV8-타겟 유전자 편집-Pro 유전자 치료 후 마우스의 Ldlr 단백질 발현이 중등도 회복되었으며, 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화 증상도 일부 개선된 것으로 나타났다. 이는 AAV8-타겟 유전자 편집-Pro가 체내 Ldlr 복구 치료에 일정한 효과를 가짐을 시사한다.
결론
임상 환자에서 가능한 새로운 병인 유전자를 발견하고 점 돌연변이 마우스 모델을 구축함으로써, 점 돌연변이와 질환 사이의 인과관계가 입증되었다. LDLR E207X 점 돌연변이는 유전자의 기능을 손상시키고 혈중 저밀도지질단백질(LDL) 농도를 증가시켜 급성 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화 증상을 유도한다. 또한 AAV8-타겟 유전자 편집-Pro 유전자 치료가 질환 증상을 완화할 수 있음이 추가로 입증되었다. AAV8-타겟 유전자 편집-Pro 발현 벡터는 간에서 LDLR 유전자의 기능을 수정함으로써 혈중 LDL 농도를 감소시킬 수 있으며, 이는 고콜레스테롤혈증 및 동맥경화 완화에 치료적 역할을 할 수 있다. 종합적으로 이러한 결과는 가족성 고콜레스테롤혈증의 병인 가설 및 잠재적 치료 옵션 제시에 기여하였다.
Cyagen 소개
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참고문헌
체내 AAV-타겟 유전자 편집/Cas9 매개 유전자 편집이 가족성 고콜레스테롤혈증에서의 동맥경화를 완화한다. DOI:10.1161/CIRURCHA1191: 042476.
