대형 서열 인식 마우스 모델을 위한 RMCE
유전자 편집 연구의 초기부터, 대규모 게놈 영역을 정확히 수정할 수 있는 능력은 이 분야의 혁신을 이끄는 주요 동력으로 남아 왔습니다. 유전자 편집 기술은 지속적으로 정교해졌지만, 수정 가능한 영역의 크기는 여전히 사용된 방법에 따라 제한되어 있습니다.
대규모 게놈 수정을 가진 마우스 모델을 개발하는 것은 많은 기관 코어 및 기업에게 도전적인 과제였습니다. 유전자 교체 치료에 사용되는 전체 유전자의 교체 연구는 유전자 편집 기술의 한계를 극복하려는 시도를 자주 요구합니다. 대형 서열 녹아웃(LFKI) 역시 제한된 범위 내에서 사용되며, 조건부, 보고자(reporter), 전사형(transgenic), 인간화(Humanized) 마우스 모델 개발에 활용됩니다. 전체 유전자의 교체 및 대형 서열 녹아웃 프로젝트의 경우, 특정 위치 재조합의 일종인 재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE) 접근법을 통해 최대 300 kb까지의 녹아웃이 가능한 마우스 모델을 제공할 수 있습니다.
특정 위치 재조합 및 관련 게놈 수정 전략
특정 위치 재조합효소(SSRs)를 이용한 유전적 재조합은 일정 수준의 서열 동질성을 공유하는 DNA 세그먼트 간에 DNA를 교환하여, 관심 유전자를 타겟팅하여 도입하는 방식을 제공합니다. SSRs는 일반적으로 30~200 염기쌍 길이의 재조합 부위 내에서 DNA를 재배열합니다. 재조합은 재조합효소가 재조합 부위에 결합할 때 발생하며, 이 부위는 부분적인 역반복 대칭 구조를 가진 두 가지 모티프로 구성됩니다. 이러한 부위의 상대적 방향성 및 분자적 위치는 유전자를 역전시키거나 제거하거나 삽입하는 등의 재조합 사건의 유형을 결정합니다. 특히 삽입을 위해서는 두 개의 서로 다른 DNA 분자에 위치한 재조합 부위 사이에서 분자 간 재조합이 필요하며, 하나의 DNA 분자는 원형이어야 합니다.
SSR 기반 전략의 예시:
- Cre-lox 시스템(또는 유전자 플록싱) – 유전자 발현의 시간적 및 공간적 조절
- 재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE) – 최대 300 kb까지의 대규모 유전자 서열 삽입; 비교 연구를 위한 여러 변종 모델 생성
재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE)의 응용
재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE)은 특정 위치 재조합을 활용하여 고등 진핵생물 게놈에 대해 체계적이고 반복 가능한 수정을 수행합니다. RMCE 접근법은 전체 유전자의 교체 및 대형 서열 녹아웃 마우스 모델 프로젝트에 적합하며, 일반적으로 조건부, 보고자, 전사형, 인간화 마우스 모델 개발에 사용됩니다.
RMCE 기술은 관심 유전자(GOI)를 기존의 유전자 캐시트(유전자 및 재조합 부위 포함)와 동일한 캐시트로 교환함으로써 GOI를 통합합니다. 이를 위해 원시 유전자는 두 개의 고유한 인식 부위로 둘러싸여 있으며, 변형된 GOI를 포함한 DNA 플라스미드 역시 동일한 두 개의 인식 부위로 둘러싸여 있습니다. 이 과정에서 재조합효소(예: Cre)를 사용하여 원시 유전자를 변형된 GOI로 교체합니다.
대형 서열 녹아웃 모델 – 인간화, 전사형, 보고자, 조건부
재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE) 접근법은 대규모 유전자 서열의 삽입에 매우 강력한 도구로 남아 있으며, 조건부, 보고자, 전사형 마우스 모델을 효율적으로 생성하는 데 사용될 수 있습니다. RMCE는 관심 유전자(GOI)의 매우 높은 효율적인 전달을 제공하며, 인간화 마우스 모델을 쉽게 개발할 수 있도록 적합합니다. 이는 마우스에서 인간의 발현 패턴을 재현할 수 있기 때문입니다. 우리의 프로젝트 전략을 통해, BAC 융합 및 3단계 타겟팅을 활용한 RMCE 기반 기술을 통해 최대 300 kb까지의 대형 서열 녹아웃(LFKI) 인간화 및 유전적 수정을 달성하였습니다!
비교 분석을 위한 변종 모델 개발
또한, 재조합효소 매개 캐시트 교환(RMCE) 기술은 대규모 돌연변이 스크리닝, 도메인 특이적 단백질 기능의 특성화 및 기타 비교 연구를 위한 여러 변종 모델을 생성하는 데 사용될 수 있습니다. RMCE는 돌연변이를 부모 배아 줄기(ES) 세포 클론에 직접 삽입할 수 있으며, 다양한 타겟 벡터와 함께 사용하여 추가적인 변종 세포 및 마우스 라인을 쉽게 생성할 수 있습니다. 부모 ES 클론 라인 하나만으로도 전체 범위의 고유한 변종 세포 라인과 이후 변종 마우스 라인을 생성할 수 있으므로, RMCE는 시간을 절약하고 프로젝트 비용을 줄일 수 있습니다. RMCE는 연구자들이 점 돌연변이, 대규모 유전자 돌연변이를 포함하여, 전체 유전자를 다른 GOI로 교체하는 등 대규모 게놈 연구에 매우 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 변종 모델을 생성할 수 있도록 합니다.
대형 서열 녹아웃 마우스 모델
Cyagen은 TurboKnockout™ 또는 타겟 유전자 편집 기술을 활용하여 내재 유전자 위치 및 Rosa26 위치 모두에서 대형 서열 녹아웃 마우스 모델을 성공적으로 개발하였습니다. 우리는 엔지니어링된 부모 ES 세포 라인 생성부터 연구용 맞춤형 마우스 모델 제공에 이르기까지 완전한 서비스를 제공합니다.
우리 팀이 수행한 수천 건의 녹아웃 마우스 모델 프로젝트 데이터를 바탕으로, 우리 유전자 편집 기술이 대규모 게놈 영역 수정의 경계를 어떻게 확장하는지에 대한 새로운 정보를 수집하였습니다. 아래에서는 Cyagen의 유전자 편집 기술을 통해 제공하는 대형 서열 녹아웃(LFKI) 능력을 정리하였습니다.
| TurboKnockout™ | 타겟 유전자 편집-Pro 유전자 편집 | |
| 접근법 | 자사 특허 기술인 TurboKnockout™를 활용한 ESC 내 동질성 재조합 | 수정핵 주입을 통한 타겟 유전자 편집-Pro 내재 효소 매개 유전자 타겟팅 |
| 응용 분야 | 조건부 녹아웃(cKO) 점 돌연변이 대형 서열 녹아웃(KI) 인간화(Humanized) | 조건부 녹아웃(cKO) 점 돌연변이 대형 서열 녹아웃(KI) 전역 녹아웃 |
| 녹아웃(KI) 서열 크기 제한 | 유전자 타겟팅 1회당 ~20 kb RMCE 인간화: ~300 kb | 내재 유전자: ~15 kb Rosa26/H11: ~12 kb |
| 조건부 녹아웃(cKO) | 단일 타겟: ~7 kb 이중 타겟: ~100 kb |
도너 벡터: ~7 kb ssDNA: ~100 kb |
| 도너 배경 | 마우스 품종: C57BL/6, BALB/c | 마우스 품종: C57BL/6, FVB 쥐 품종: Sprague-Dawley(SD), Long Evans |
| 소요 시간 | 6~8개월 | 5~7개월 |
