발생 및 병적 리모델링 과정에서 심장 챔버 특성화 연구의 진전

Nppa(natriuretic peptide A)는 심장 발달 과정에서 시공간적 발현이 동적으로 변하는 심장 호르몬입니다. 출생 전 Nppa mRNA 발현은 처음 심실에서 관찰된 후 심방이개로 발현 부위가 이동합니다. 건강한 출생 후 심장에서 Nppa 발현은 심방에만 제한되어 있으며, 병리적 스트레스에 반응하여 성인 심실에서 태아 유전자 활성화 프로그램의 일부로 재발현됩니다.

이러한 Nppa의 독특한 발현 패턴으로 인해 Nppa 심장 유전자는 심장의 챔버 형성 및 특화 연구, 심장 비대 및 심부전의 분자 메커니즘 연구의 중요한 마커로 광범위하게 연구되어 왔습니다. 본 논문에서는 기존 Nppa 리포터 마우스 라인의 한계를 밝히고, 심장 발달 및 질병 병리 연구 개선을 위한 새로운 모델을 제시합니다.

기존 모델의 한계

심방 발달 및 챔버 특화 연구를 위해 여러 Nppa 리포터 마우스 라인이 제안되었으나, 기존 모델은 내인성 Nppa의 독특한 시공간적 발현 패턴을 정확하게 재현할 수 없었습니다. 과거 연구에서 사용된 주요 Nppa 리포터 모델 두 가지와 심장 발달 연구에서의 한계를 아래에서 설명합니다:

1. 대부분의 경우 리포터 유전자와 결합된 랫트 Nppa 프로모터 단편을 보유한 트랜스제닉 마우스 라인이 사용되었습니다: 이 모델은 Nppa 리포터 활성을 제공하지만 내인성 Nppa와는 발현 패턴이 매우 달랐습니다.
2. 내인성 Nppa 발현 패턴을 더 정확하게 반영하기 위해 마우스의 더 큰 Nppa cis 조절 서열을 사용하여 Cre 재조합효소 발현을 유도했습니다. 그러나 불완전한 Cre 재조합으로 인해 리포터 발현이 불균일했습니다.

이러한 결과는 트랜스제닉 마우스 생성에 사용된 Nppa 조절 서열이 심장 발달 과정에서 Nppa의 동적 발현을 제어하는 데 필요한 모든 조절 서열을 포함하고 있지 않음을 시사합니다. 또한 표준 트랜스제닉 접근법은 일반적으로 리포터 유전자가 표적 게놈에 비특이적으로 통합되어 리포터 유전자 복제 수가 가변적이므로, 비생물학적 수준의 리포터 유전자 발현을 초래합니다.

Nppa-tagBFP 리포터 녹인 마우스 라인 개발

배아줄기세포(ESC) 매개 상동 재조합이라는 특정 녹인 접근법을 사용하여 기존 모델의 단점을 해결한 새로운 Nppa 리포터 마우스 라인이 개발되었습니다. 상세한 개발 전략과 결과는 그림 1에 제공되어 있습니다.

그림 1: Nppa-tagBFP 리포터 녹인 마우스 라인 개발. (a) 유전자 타겟팅 전략의 개략도. IRES-tagBFP-FRT-NeoR-FRT 카세트를 Nppa 유전자 좌위의 3'-UTR에 삽입했습니다. NeoR 유전자 카세트는 두 개의 FRT 부위로 둘러싸여 있습니다. 상동 재조합을 통해 IRES-tagBFP-FRT-NeoR-FRT 카세트(표적 대립유전자)를 보유한 마우스를 생성했습니다. 키메라 마우스를 FLP 트랜스제닉 마우스와 교배하여 NeoR 카세트를 제거함으로써 구성적 녹인 대립유전자를 보유한 Nppa-tagBFP 녹인 마우스를 생성했습니다. (b) (a)에 표시된 PCR 프라이머를 사용하여 표적 ESC를 PCR 스크리닝한 결과. 증식된 9개 클론에서 예상 크기의 PCR 밴드(5.3 kb)가 확인되었습니다. 야생형(WT) 클론에서는 밴드가 관찰되지 않았습니다. (c) 정확하게 표적화된 ESC 클론을 확인하기 위한 서던 블롯 분석. 9개의 PCR 양성 ESC 클론 중 6개(1, 2, 3, 5, 6, 7)를 사용하여 (a)에 표시된 제한 효소로 절단하고 표시된 서던 프로브와 혼성화를 수행했습니다. Nppa-tagBFP 녹인을 위한 표적 ESC는 SacI 처리 시 7.6 kb, EcoRI 처리 시 6.9 kb 밴드를 나타낸 반면, WT ESC에서는 밴드가 관찰되지 않았습니다. 서던 블롯 결과는 증식된 6개 클론(1, 2, 3, 5, 6, 7) 모두가 정확하게 표적화되었음을 확인했습니다.

tagBFP 리포터 카세트를 Nppa 유전자의 3'-UTR에 녹인하여 내인성 Nppa 프로모터 영역을 유지함으로써, 트랜스제닉 리포터 모델에서 흔히 발견되는 부적절하게 제어된 리포터 발현 가능성을 제거했습니다¹. 기존 트랜스제닉 모델과 비교하여 이 새롭게 제시된 Nppa-tagBFP 리포터 녹인 마우스 라인은 출생 전후 심장 발달 과정에서 Nppa의 동적이고 복잡한 시공간적 발현 패턴을 정확하게 복제합니다. 또한 병리적 심장 스트레스에 의해 Nppa-tagBFP 발현이 유도되므로, 리포터가 심장의 병리적 리모델링에 대한 시각적 지표로 기능할 수 있습니다. 더욱이 녹인 대립유전자를 보유한 이형접합 및 동형접합 마우스 모두 건강하고 번식력이 있습니다. 이러한 모든 이유로 새로운 Nppa-tagBFP 리포터 녹인 마우스는 심장 발달 중 챔버 형성 및 특화 연구와 심장 질병 중 태아 유전자 재활성화 연구에 유용한 도구로 사용됩니다.

맞춤형 유전자 타겟팅을 통한 동물 모델 개선

사이아젠의 ESC 매개 유전자 타겟팅 역량은 리포터 서열의 특정 통합을 가능하게 하여 Nppa 유전자의 생물학적 발현 수준을 유지하므로, 기존 Nppa 리포터 모델의 단점을 해결하고 발달 중 심장 챔버 특화 및 병리적 심장 리모델링 연구에 매우 유망한 새로운 모델을 제공합니다. 사이아젠이 사용하는 다양한 유전자 타겟팅 기술은 광범위한 질병 병리에 대한 내인성 발현 패턴을 복제하는 리포터 모델 생성에 유사한 이점을 제공할 수 있습니다.

사이아젠의 새롭고 가속화된 ESC 기반 접근법인 TurboKnockout^®는 조건부 녹아웃, 리포터 녹인 및 인간화 마우스를 최소 6개월 만에 생성할 수 있습니다. 이는 자가 삭제 선택 카세트와 초적합 ES 세포주라는 두 가지 혁신을 통해 가능해졌으며, 이 두 가지를 결합하여 2세대의 교배 과정을 생략합니다. 조건부 녹아웃의 경우 ES 세포로 만든 파운더 동물을 조직 특이적 Cre 마우스와 직접 교배할 수 있습니다.

또한 사이아젠은 트랜스제닉 모델 생성 시 직면하는 문제를 해결할 수 있는 유전자 타겟팅 기술을 제공합니다. 당사의 독자적인 PiggyBAC 트랜스제닉 마우스 서비스는 트랜스진 서열의 정확한 통합으로 단일 카피 트랜스제닉 마우스를 제공하여 더 일관된 발현을 보장합니다. 사이아젠은 또한 PiggyBAC 트랜스제닉 랫트 서비스를 제공하여 맞춤형 랫트 모델에도 동일한 이점을 제공합니다.

세계 최고의 맞춤형 마우스 및 랫트 모델 제공업체로서 사이아젠은 전문적인 지원, 효율성, 경제성과 함께 업계 최고의 보장을 제공합니다 – 동물이 제공되지 않으면 비용이 청구되지 않습니다. 지금 바로 문의하여 다음 동물 모델 프로젝트에 대한 무료 상세 유전자 타겟팅 전략을 요청하고 사이아젠이 어떻게 귀하의 연구를 가속화할 수 있는지 확인하십시오.

참고 문헌

1. Zhang, Z., Zhang, Q., Lal, H., & Nam, Y. (2019). Generation of Nppa‐tagBFP reporter knock‐in mouse line for studying cardiac chamber specification. Genesis. doi:10.1002/dvg.23294