ROSA26: 마우스 게놈 내 '안전 항구' 위치
‘안전항구(safe harbor)’라는 말을 들었을 때 가장 먼저 떠오르는 것은 무엇입니까? 오늘 우리가 논의하고자 하는 ‘안전항구’는 배가 정박하는 항구가 아니라, 마우스 게놈 내 외부 유전자의 타겟 통합을 위한 안정적인 유전자 위치를 의미합니다. 마우스 게놈 내에서 가장 잘 알려진 안전항구 중 하나인 ROSA26에 대해 살펴보겠습니다.
무작위 통합의 단점
유전자 기능을 연구하기 위해 세포주 또는 모델 생물체를 사용할 때, 일반적으로 타겟 유전자의 세포 또는 동물 내에서의 특정 기능 및 조절 메커니즘을 파악하기 위해 기능 증가(Gain of function) 또는 기능 손실(Loss of function) 전략을 사용합니다. 기능 증가는 주로 타겟 유전자 과발현을 위해 타겟 유전자 편집(Knock-in, KI) 기술을 통해 이루어지며, 기능 손실은 주로 유전자 녹아웃(Knockout, KO)을 통해 달성됩니다. 본 논문에서는 주로 KI, 즉 과발현 모델에 대해 논의합니다. 타겟 유전자 편집(KI)이란 전이된 기능성 유전자 또는 유전자 조각을 전이 또는 동형 재조합 기술을 통해 게놈에 삽입하여 세포 내에서 기능을 수행할 수 있도록 하는 기술을 의미합니다.
전통적인 전이 유전자 기술을 통해 제작된 마우스에서 전이된 유전자가 무작위로 통합되면서, 통합 부위에 따라 복제 수가 불확실해지며, 안정적인 단백질 발현을 가진 후손 마우스를 선별해야 하는 문제가 발생합니다. 또한, 복제 수의 감소 및 통합 부위 주변 유전자의 억제로 인해 1세대 마우스의 표현형이 전달 과정에서 쉽게 소실되며, 이후 라인 확보 및 반복 실험에 큰 불편을 초래합니다.
전이된 유전자가 안정적으로 고발현되면서 주변 유전자의 발현에 영향을 주지 않는 위치는 존재할 수 있을까요? 안정적인 유전자 발현을 위해 선별 과정 없이 마우스를 확보하기 위해서는 외부 유전자를 위한 신뢰할 수 있는 ‘안전항구’를 제공할 필요가 있습니다. 이러한 ‘안전항구’ 내에서는 외부 유전자가 안정적이고 효율적으로 발현되며, 관련 세포 및 조직의 정상 기능에 부작용을 초래하지 않습니다.
ROSA26의 발견
연구자들은 마우스 게놈 내 다양한 유전자 삽입 부위를 시험한 결과, 어떤 DNA도 매우 안정적이고 안전하게 삽입 가능한 특수한 위치를 발견하였으며, 그 중 하나가 ROSA26 ‘안전항구’ 위치입니다. ROSA26의 식별은 유전공학 역사상 가장 흥미로운 발견 중 하나이며, 유전학 전반의 역사에서 가장 중요한 돌파구 중 하나로 평가받고 있습니다.
ROSA26는 Friedrich와 Soriano가 마우스 배아 줄기세포(ESCs) 내 유전자 변이를 연구할 때 처음 발견되었습니다. ROSA26는 과학계에서 공식적으로 ‘유전자 트랩 ROSA 26 [Gt(ROSA)26Sor]’로 알려져 있습니다. ROSA26는 마우스 염색체 6번에 위치한 3개의 엑손으로 구성된 비암호화 유전자로, 유전자 삽입이 용이한 영역입니다. ROSA26 유전자는 알려진 기능성 단백질을 암호하지 않습니다. 또한 ROSA26 위치는 동형 재조합(HR)을 수행하기에 용이하며, 이 영역에 삽입된 유전자 구조물의 단백질 발현 수준을 유지하며, 다른 내재 유전자의 발현 또는 기능에 영향을 주지 않습니다. 전신 세포 유형 및 발달 단계에서 광범위하게 발현되는 특성 덕분에 ROSA26 영역은 마우스 모델에서 유전자 타겟팅을 위한 안전한 위치로 자주 사용됩니다.
ROSA26 유전자 타겟 유전자 편집 모델의 분류
일반적으로 ROSA26 위치 타겟 유전자 편집(KI)은 세 가지 유형으로 나뉩니다:
- 첫 번째 유형은 원형 버전으로, 타겟 유전자의 cDNA가 ROSA26 프로모터에 의해 조절되며, 생체 내에서 지속적으로 발현됩니다(그림 a). 구체적으로, cDNA의 스플라이스 수용체(SA) 서열이 ROSA26 유전자의 첫 번째 인트론 내 XbA1 제한효소 절단 부위에 삽입됩니다. 전사 종결 캐스셋(Stop cassette)은 전사 유전자 상류에 삽입되며, 이는 네오마이신 저항성 유전자(NeoR, 양성 선택 마커)와 세 개의 폴리아데닐산(pA)으로 구성됩니다.
- 두 번째 전략은 조건부 타겟 유전자 편집(cKI)으로, 첫 번째 전략의 변형으로, 전사 종결 캐스셋 양쪽에 loxP 사이트를 삽입하여 실현됩니다(그림 b). 이 경우 전사 종결 캐스셋이 존재함으로써 전사 유전자의 발현이 억제됩니다. CRE 발현 마우스와 교배할 경우, 특정 조직에서 동형 재조합(HR)을 통해 전사 종결 캐스셋 서열이 제거되며, 사용된 CRE 마우스 품종에 따라 달라집니다. 그러나 자연적인 ROSA26 프로모터의 중간 강도는 항상 원하는 전사 유전자 발현 수준을 달성하지 못할 수 있습니다.
- 자연적인 ROSA26 프로모터의 한계를 극복하기 위해, 세 번째 전략은 외부 프로모터 또는 증폭자(예: CAG 프로모터)를 도입하여 높은 전사 유전자 발현을 유도하는 것입니다(그림 c). 또한, 전사 유전자 하류에 FRT 사이트를 양쪽에 두고 IRES-GFP 캐스셋을 삽입하여 생체 내에서 전사 유전자 발현을 시각화할 수 있습니다.
04 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 질병 모델
Tbx1 마우스 (E1-E2 녹아웃)
왼쪽: 음성 발화 빈도 및 지속 시간
오른쪽: T-마즈 자발적 교차 행동(SAB)[6]
Shank3B 마우스 (E13-E16 녹아웃)
Cntnap2 마우스 (E1 녹아웃)
05 Cyagen의 자폐 연구 마우스 모델
| 유전자 | 녹아웃 영역 | 제품 번호 | 품종 이름 |
|---|---|---|---|
| TBX1 | 엑손3 | S-CKO-17545 | C57BL/6J-Tbx1em1(flox)Cya |
| SHANK3 | 엑손4-9 | S-KO-11106 | C57BL/6J-Shank3em1Cya |
| 엑손13-16 | S-KO-16224 | C57BL/6J-Shank3em1Cya | |
| 엑손4-9 | S-CKO-12419 | C57BL/6J-Shank3em1(flox)Cya | |
| Cntnap2 | 엑손3 | S-KO-15901 | C57BL/6J-Cntnap2em1Cya |
| 엑손3 | S-CKO-17468 | C57BL/6J-Cntnap2em1(flox)Cya |
