SCA3 연구 모델 - B6-hATXN3 마우스

Spinocerebellar Ataxias

Spinocerebellar Ataxias (SCA)은 진행성 및 퇴행성 특징을 지닌 유전성 뇌 장애 그룹입니다. 이러한 질병은 주로 소뇌의 신체 운동 조정 조절에 영향을 미치며 때로는 척수에도 영향을 미칩니다.

SCA의 하위 유형은 지금까지 40개 이상 발견되었으며, 각 하위 유형은 특정 질병을 유발하는 유전자에 해당합니다[1]. SCA의 주요 증상은 보행 조정의 점진적인 상실이며, 종종 손, 말하기 및 눈 움직임의 불량한 조정이 동반됩니다. 특정 증상은 하위 유형과 환자 자체에 따라 다릅니다. 많은 경우, 환자의 정신 능력은 완전히 보존되지만 신체적 통제 능력이 점차 저하되어 운동 기능이 상실되고 사망할 수도 있습니다.

그림 1. Spinocerebellar Ataxias (SCA)의 주요 전 세계 분포 [1]

SCA의 병원성 기전

SCA는 주로 유전자의 연속적인 시이토신-아데닌-구아닌(CAG) 삼중뉴클레오티드 반복 확장에 의해 발생하며, 이는 폴리글루타민(polyQ) 질병 그룹의 특징입니다. SCA1, SCA2, SCA3를 포함한 대부분의 SCA 사례가 이 범주에 속합니다. 이들 질병의 기전은 병원성 폴리글루타민 확장 반복 서열의 길이가 증가하여 번역 과정에서 비정상적인 PolyQ 반복 서열이 생성되어 단백질의 잘못된 폴딩이 발생하는 것입니다. 잘못 접힌 PolyQ 단백질은 응집체를 형성하고, 세포 과정을 방해하고, 세포 기능 장애를 일으키고, 이어서 세포 독성 및 분해를 유도합니다. 다른 유전자 부(genetic locus)에서의 점 돌연변이, 결실 돌연변이 또는 삽입 돌연변이는 비교적 드뭅니다. Machado-Joseph병(MJD)으로도 알려진 SCA 3형은 세계에서 가장 흔하고 심각한 SCA 아형으로 전체 SCA 사례의 약 20~50%를 차지합니다. 지금 까지 치료법이 없습니다 [2].

그림 2. 정상적인 CAG 트리뉴클레오티드 반복의 기능과 비정상적인 CAG 트리뉴클레오티드 반복 확장이 SCA 발생을 초래하는 메커니즘. [2]

SCA3의 질병 기전 및 표적치료 연구

정상인의 경우, ATXN3 유전자 내 CAG 반복 횟수 범위는 10에서 44까지입니다. 그러나 SCA3 환자에서는 이 범위가 61에서 87로 확대됩니다. 이러한 과다한 CAG 반복은 돌연변이 ATXN3 유전자를 생성하여 비정상적인 Marie ataxia 단백질-3(Ataxin-3)을 인코딩합니다. 이러한 비정상적인 단백질은 모이고 독성 물질을 생성하여 자가포식, 단백질 안정성, 전사, 미토콘드리아 기능 및 신호 전달을 포함한 여러 세포 과정을 파괴하여 기능 장애와 질병을 유발합니다. 환자의 증상에는 Cerebellar ataxia, Extraocular muscle paralysis, Staring induces nystagmus, Receding eyelid, Faciolingual bundle fibrillation, 그리고 다양한 정도의 원추체 및 추체외로 증상과 말초 신경병증이 포함됩니다 [3].

그림 3. ATXN3 유전자의 다양한 범위의 CAG 반복이 Ataxin-3 단백질 기능에 미치는 영향 [3]

임상 전 단계 연구에서는 ATXN3 유전자 발현 억제, 병인성 ATXN3 단백질 침묵, 단백질 집합 방지, 독성 단백질의 가수분해 과정 억제 및 영향을 받은 세포 시스템의 기능 장애를 상쇄하는 것이 일부 치료 효과를 나타내었습니다. 그러나 현재 임상 단계에 진입한 SCA3 치료법은 매우 제한적이며, 관련 연구는 여전히 강화되어야 합니다. 임상 시험을 시작하기 전에 치료 방법에 따라 각각 다른 유형의 동물 모델을 사용하여 엄격하게 평가해야 합니다. 예를 들어, ATXN3 표적 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 치료법 개발 연구에서 선도적인 소핵산 의약품 회사인 아이오니스는 표적 분자의 스크리닝 및 스크리닝을 위해 인간 ATXN3 유전자를 발현하는 다양한 마우스 모델을 사용하여 대상 분자의 선별과 약리학적 검증에 활용했습니다 [4-7].

그림 4: ATXN3 mRNA 또는 ATXN3 단백질 및 기타 다양한 SCA3 치료법의 표적화.

Cyagen은 B6-hATXN3 마우스 모델을 개발하여 인간 Atxn3 유전자를 성공적으로 표현했습니다(제품번호: C001398). 이 모델을 기반으로 인기 있는 병원성 돌연변이를 갖는 인간화 질병 모델을 구축하여 타겟 유전자 편집, ASO, siRNA, miRNA 등의 신진 연구 요구를 충족시킬 수 있습니다. 아래는 해당 모델의 자세한 정보입니다.

B6-hATXN3 마우스가 인간 ATXN3 유전자를 성공적으로 표현했다

일반적인 B6-TG(ATXN3-84Q) 마우스는 인간 ATXN3 유전자와 마우스 Atxn3 유전자를 모두 발현합니다. RT-qPCR 결과에 따르면 B6-hATXN3 마우스와 B6-TG(ATXN3-84Q) 마우스는 인간 ATXN3 유전자의 발현 수준이 가까웠으며 B6-hATXN3은 인간 유전자만 발현하고 마우스 유전자는 발현하지 않는 것으로 나타났습니다.

그림 5. 야생형 마우스(B6N), B6-hATXN3 마우스 및 B6-TG(ATXN3-84Q) 마우스에서의 유전자 표현 검출

B6-hATXN3 마우스 뇌는 인간 ATXN3 단백질을 성공적으로 표현합니다

Western Blot 결과에 따르면, 야생형 마우스의 뇌는 오직 마우스 ATXN3 단백질(약 42KD)만을 발현하며, B6-hATXN3 마우스의 뇌는 오직 인간 ATXN3 단백질(약 48KD)만을 발현합니다. B6-TG(ATXN3-84Q) 마우스의 뇌는 긴 PolyQ 구조 돌연변이가 있는 인간 ATXN3 단백질과 마우스 ATXN3 단백질을 동시에 발현하며 인간 ATXN3-84Q 단백질(약 65KD)과 마우스 ATXN3 단백질(약 42KD)의 밴드가 있습니다.

그림 6. 마우스의 뇌 조직에서 인간 ATXN3 단백질 발현 검출

결론

B6-hATXN3 마우스 모델(제품번호: C001398)은 인간 ATXN3 유전자를 효과적으로 발현할 수 있으며, 마우스 내인성 Atxn3 유전자는 발현하지 않습니다. 뇌에는 인간 ATXN3 단백질이 상당하게 발현됩니다. 따라서 이 모델은 SCA3 질환 연구에 사용될 수 있습니다.

또한, Cyagen은 자체 개발한 TurboKnockout 융합 BAC 재조합 기술을 활용하여 이 모델을 기반으로 인기있는 점 돌연변이 질환 모델을 제공할 수 있으며, 다양한 점 돌연변이에 따라 맞춤형 서비스를 제공하여 SCA3 질환 약물 스크리닝 및 약리학 등의 실험 요구를 충족시킬 수 있습니다.

참고 문헌

[1]Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellar ataxia. Nat Rev Dis Primers. 2019 Apr 11;5(1):24.

[2]Sullivan R, Yau WY, O'Connor E, Houlden H. Spinocerebellar ataxia: an update. J Neurol. 2019 Feb;266(2):533-544. doi: 10.1007/s00415-018-9076-4. Epub 2018 Oct 3.

[3]Matos CA, de Almeida LP, Nóbrega C. Machado-Joseph disease/spinocerebellar ataxia type 3: lessons from disease pathogenesis and clues into therapy. J Neurochem. 2019 Jan;148(1):8-28.

[4]Moore LR, Rajpal G, Dillingham IT, Qutob M, Blumenstein KG, Gattis D, Hung G, Kordasiewicz HB, Paulson HL, McLoughlin HS. Evaluation of Antisense Oligonucleotides Targeting ATXN3 in SCA3 Mouse Models. Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Jun 16;7:200-210.

[5]Toonen LJA, Rigo F, van Attikum H, van Roon-Mom WMC. Antisense Oligonucleotide-Mediated Removal of the Polyglutamine Repeat in Spinocerebellar Ataxia Type 3 Mice. Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Sep 15;8:232-242.

[6]McLoughlin HS, Moore LR, Chopra R, Komlo R, McKenzie M, Blumenstein KG, Zhao H, Kordasiewicz HB, Shakkottai VG, Paulson HL. Oligonucleotide therapy mitigates disease in spinocerebellar ataxia type 3 mice. Ann Neurol. 2018 Jul;84(1):64-77.

[7]McLoughlin HS, Gundry K, Rainwater O, Schuster KH, Wellik IG, Zalon AJ, Benneyworth MA, Eberly LE, Öz G. Antisense Oligonucleotide Silencing Reverses Abnormal Neurochemistry in Spinocerebellar Ataxia 3 Mice. Ann Neurol. 2023 Oct;94(4):658-671.