시력을 지키기 위한 연구: 안과 질환의 유전적 요인 표적화

유전자는 안과 질환의 발병 기전에 매우 중요한 역할을 하며, 그 중 일부는 소아와 성인에게 매우 높은 유병률을 보입니다. 소아 실명 사례의 60% 이상이 유전적 요인(선천성 녹내장, 안구 기형, 시신경 위축 및 색소성 망막염)으로 인해 발생합니다. 성인의 경우에도 유전적 요인은 녹내장, 황반 변성을 포함한 심각한 안과 질환과 관련될 수 있습니다.

지난 15년간의 설치류 모델 구축에 대한 사이아젠의 경험을 살펴보면, 저희는 안과 질환과 관련된 유전자 변이에 대한 많은 마우스 모델을 구축했습니다. 예를 들어, Cep290 녹아웃(KO) 마우스는 라버 선천성 흑내장 10(LCA10) 연구를 위해 개발되었습니다. 뿐만 아니라 사이아젠은 유전성 안과 질환 연구를 포함하여 질환 연구에 더욱 유용한 인간화 마우스 모델을 지속적으로 개발하고 있습니다. 다음 내용에서는 안과 질환 연구에 사용되는 몇 가지 안과 관련 인간화 마우스 모델을 소개하겠습니다.

안과 질환에서의 인간화 마우스 응용

인간의 건강과 질환을 더 잘 이해하기 위해 연구자들은 인간 DNA를 보유한 다양한 마우스 모델을 구축합니다. 이러한 인간화 마우스는 기존 트랜스제닉 모델보다 생리적 관련성이 높도록 설계되었으며, 이는 관심 유전자의 정확한 게놈 맥락을 유지하여 생리적 발현 수준과 정확한 시공간 발현 패턴을 보존하는 것을 포함합니다. 비코딩 인간 서열이 통합되는 경우, 인간 특이적 조절 및 인간 유전자 스플라이스 이소폼이 유지될 수 있습니다. 또한 번역된 단백질은 돌연변이 발생 시 잠재적으로 독특한 유해 특성을 포함하여 인간 유사체의 고유한 생화학적 특성을 나타낼 것으로 예상됩니다.^[1]

고정된 유전적 배경을 가진 마우스 모델은 망막 내 유전자의 기능, 유전자 파괴로 유도되는 병리 기전을 이해하고 해당 인간 안과 질환을 치료하기 위한 실험적 접근법을 테스트하는 데 유용할 수 있습니다.

라버 선천성 흑내장(LCA)용 인간화 녹인 마우스 모델

Cep290 인간화 모델의 구축

마우스 Cep290 유전자는 53개의 엑손을 포함하며(인간보다 1개 적음), 인간 CEP290과 DNA 수준(86%) 및 단백질 수준(상동성 87%, 유사성 94%)에서 높은 상동성을 공유합니다(그림 1A). 심층 인트론 부위의 LCA 유발 돌연변이와 관련된 유전자형 및 표현형을 모방하는 인간화 녹인 마우스 모델을 구축하기 위해 마우스 엑손 25(mE25)와 26(mE26), 그리고 인트론 25(mI25)를 인간 상동 서열(hE26, hI26/hI26mut 및 hE27)로 대체하는 재조합 전략이 설계되었습니다(그림 1B). 모든 재조합 이벤트는 PCR 및 서던 블롯 분석으로 검증되었습니다(데이터 미제시). 분리된 양성 ES 세포 클론을 배반포에 주입하고 가임신 암컷에 이식했습니다. 높은 키메라 수컷을 Cre 제거 암컷과 교배하여 NEO 카세트를 절제했습니다. 생성된 이형접합 마우스를 사용하여 생존 가능하고 번식력이 있는 동형접합 동물을 얻었습니다. 후속 교배는 동형접합 동물 간에 수행되었습니다.

그림 1. Cep290 인간화 마우스 모델의 구축. (A) 인간과 마우스의 CEP290 유전자 구조(축척에 맞게 그려짐). (B) 마우스 Cep290 유전자에 LCA 유발 돌연변이(*로 표시)가 있거나 없는 인간 엑손 26, 27 및 인트론 26을 도입하여 두 가지 마우스 모델을 생성했습니다. 인간과 마우스 유전자좌, 타겟팅 벡터 및 재조합 유전자좌가 표시되어 있습니다. 화살표와 문자는 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타냅니다^[2].

본 연구에서는 마우스 Cep290의 인간화가 일반적으로 유전자 발현을 손상시키지 않았지만, 마우스의 스플라이싱 기계는 인트론성 CEP290 돌연변이에 의해 생성되는 인간 스플라이스 수용체 부위 또는 스플라이스 공여체 부위를 인식하지 못하는 것으로 나타났으며, 이는 인간과 마우스 간의 스플라이스 부위 인식에 차이가 있음을 시사합니다. 또한 마우스 인트론을 인간 인트론으로 대체하면 마우스 망막에서 강하게 발현되지만 인간 망막이나 섬유아세포에서는 발견되지 않는 또 다른 숨겨진 엑손이 생성되었습니다. 이들의 데이터는 마우스와 인간 간의 스플라이싱 기계에 종 특이적 차이가 있음을 시사하며, 이는 스플라이싱에 영향을 미치는 유전적 변이의 기저 병원성 기전을 연구하는 데 마우스가 항상 적합한 모델이 아닐 수 있음을 나타냅니다.

그러나 과거에 여러 유전 질환에 대한 스플라이스 부위 돌연변이의 병태생리학적 기전을 모방하기 위해 인간화 녹인 마우스 모델을 성공적으로 사용한 사례도 있습니다.

Jordan T. Gladman 등은 내인성 마우스 Smn 유전자와 상동 재조합을 사용하여 엑손 7에 C>T SMN2 변이를 삽입하여 새로운 SMA 모델을 구축했습니다^[3]. 비교 게놈학 및 생체 내 스플라이싱 분석을 사용하여 마우스 Smn과 인간 SMN 유전자가 동일한 많은 pre-mRNA 스플라이싱 요소에 의해 엑손 7 수준에서 조절된다는 것을 입증했습니다. 또한 SMN2 유전자의 엑손 7에 있는 C>T 변이를 마우스 Smn 유전자에 조작하면 엑손 7 pre-mRNA 건너뛰기가 증가합니다. 상동 재조합을 사용하여 변형된 Smn C>T 대립유전자는 내인성 Smn 프로모터의 제어 하에 있고 정확한 게놈 맥락에 위치합니다. 생성된 마우스에 대한 생화학적, 조직학적 및 행동 분석은 일부 쿠겔버그-벨란더 SMA 환자에서 관찰되는 뒷다리 악력 감소, 운동 활동 감소 및 비대성 골격근 섬유를 포함한 경증 성인 발병형 SMA와 일치합니다. 마우스의 수명이 연장되어 발달 후기 시점에 질병 치료가 가능하며, 이는 다른 SMA 마우스 모델의 수명을 능가합니다. 따라서 이 모델은 사용 가능한 SMA 동물 모델의 스펙트럼을 추가하는 이점이 있으며 질병 표현형 조절 인자 테스트 및 엑손 7 스플라이싱에 직접 영향을 미치는 치료법 개발을 가능하게 합니다.

마우스 모델은 여전히 스플라이싱 돌연변이의 유전 연구에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 일부 독특한 스플라이스 돌연변이의 경우 적합한 동물 모델을 아직 찾아야 하며 윤리적 문제에 직면할 수도 있습니다.

사이아젠은 무엇을 제공할 수 있습니까?

지난 1년간 사이아젠은 안과 유전자 치료 플랫폼 구축에 집중했습니다. 저희는 안과 질환 모델 구축부터 AAV 주입, 시험관 내 및 생체 내 약력학 평가까지 안과 질환에 대한 원스톱 솔루션을 제공하는 것을 목표로 합니다.

계속됩니다:

아래의 다음 기사를 방문하시면 상염색체 우성 색소성 망막염(ADRP)에 사용되는 마우스 모델의 응용에 대한 자세한 내용을 확인하실 수 있습니다.

>>더 알아보기: 상염색체 우성 색소성 망막염(ADRP) 및 ADRP 마우스 모델

참고문헌:

[1] Zhu F, Nair RR, Fisher EMC, Cunningham TJ. Humanising the mouse genome piece by piece. Nat Commun. 2019 Apr 23;10(1):1845. doi: 10.1038/s41467-019-09716-7. PMID: 31015419; PMCID: PMC6478830.

[2] Garanto A, van Beersum SE, Peters TA, Roepman R, Cremers FP, Collin RW. Unexpected CEP290 mRNA splicing in a humanized knock-in mouse model for Leber congenital amaurosis. PLoS One. 2013 Nov 6;8(11):e79369. doi: 10.1371/journal.pone.0079369. PMID: 24223178; PMCID: PMC3819269.

[3] Gladman JT, Bebee TW, Edwards C, Wang X, Sahenk Z, Rich MM, Chandler DS. A humanized Smn gene containing the SMN2 nucleotide alteration in exon 7 mimics SMN2 splicing and the SMA disease phenotype. Hum Mol Genet. 2010 Nov 1;19(21):4239-52. doi: 10.1093/hmg/ddq343. Epub 2010 Aug 12. PMID: 20705738; PMCID: PMC2951869.