AAV 유전자 편집이 XLRP 모델에서 망막 퇴행을 회복시킴
망막색소변성증 GTPase 조절자(RPGR) 유전자 내 변이는 X-연관 망막색소변성증(XLRP)과 관련이 있으며, 이는 망막색소변성증(RP) 전체 사례의 10%에서 20%를 차지하며 가장 심각한 형태 중 하나입니다. 본 연구에서는 RPGR 유전자 변이로 인한 XLRP에 대한 잠재적 유전자 치료법 개발에 이르기까지의 연구 절차를 검토합니다.
저자는 RPGR 변이 마우스 모델을 구축하였습니다. 표현형 분석을 통해 모델의 대표적 표현형을 확인한 후, 재조합 시스템을 rAAV를 통해 병변 마우스에 전달하였습니다. 동질성 유도 복구(HDR)를 이용하여 AAV-타겟 유전자 편집-Pro를 매개로 한 유전자 편집 치료의 우수한 치료 효과를 입증하였습니다. 본 연구는 RPGR 유전자 변이로 인한 XLRP에 대한 유전자 치료법을 발견하였으며, 이 질환을 앓고 있는 환자들에게 희망을 제시하였습니다.
1. 기초 연구 아이디어
❖RPGR 녹아웃(KO) 마우스 모델을 구축하였습니다. 이 기전은 조기 번역 종결을 유도하는 염기서열 삭제로, 무기능 알레일(null allele)로 작용합니다. 표현형 분석 결과, 광수용체 퇴행 및 광수용체 단백질의 비정상적 발현이 확인되었습니다.
❖AAV-타겟 유전자 편집-Pro를 매개로 한 유전자 편집 치료는 광수용체 세포 퇴행과 같은 증상을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있습니다.
2. RPGR 녹아웃(KO) 마우스 모델 구축
저자는 RPGR 유전자 엑손 8를 타겟으로 하는 두 개의 sGuide 분자(도구)를 설계하였습니다(Fig. 1A). 이후, in vitro 전사된 Cas9 mRNA와 sGuide 분자를 C57BL/6J 마우스의 수정란에 주입하여 RPGR 녹아웃 마우스 모델을 구축하였습니다. 그리고 산서 염기서열 분석을 통해 모델의 성공적인 구축이 확인되었습니다(Fig. 1B).
저자들은 엑손 8에서 5bp 삭제(c.974_978delAAATT; p.K325Nfs*1)를 가진 마우스(Fig. 1C)를 다음 연구에 사용하였습니다. WT 마우스에서 RPGR의 발현 및 국소화를 분석한 결과, 연결 섬모에서 더 밝은 점状 면역 반응이 관찰되었습니다. 반면, RPGR 녹아웃 망막에서는 RPGR 염색이 검출되지 않았습니다(Fig. 1D). 따라서 5bp 삭제는 RPGR의 기능 상실을 초래합니다.
3. RPGR 녹아웃(KO) 마우스 모델의 병변 표현형
저자는 5bp 삭제 마우스 모델에 대해 철저한 표현형 분석을 수행하였습니다. WT 및 RPGR 녹아웃(KO) 마우스의 망막 기저부 영상 촬영(Fig. 2A)을 통해, 3개월령 RPGR KO 마우스에서 망막 기저부 전 영역에 걸쳐 다수의 작은, 균일하게 분포된 황백색 반점이 관찰되었습니다. 광수용체가 퇴행함에 따라 이 반점들은 점차 커지고 융합됩니다. 12개월령에는 반점이 희박해지지만, 과색소침착이 두드러집니다.
WT 및 RPGR KO 마우스의 조직학적 평가를 통해, 6개월령에 외핵층(ONL)에서 경미한 노화 관련 광수용체 세포 손실이 관찰되었습니다. 12개월령에는 RPGR KO 마우스에서 광수용체 세포 손실이 명확하게 나타났습니다(Fig. 2B).
저자들은 ONL 두께를 측정하여 WT와 변이 마우스 간에 유의미한 차이가 있음을 확인하였습니다(Fig. 2C). 형태학적 퇴행과 함께, 전기망막도(ERG)로 측정한 망막 기능도 비정상적으로 나타났습니다.
3개월령 RPGR KO 마우스의 어두운 적응 ERG는 WT 마우스와 유의미한 차이가 없었지만, b파형 진폭은 감소하였습니다(Fig. 2D). 6개월령에는 a파형 및 b파형 진폭 모두가 더욱 감소하였으며, 12개월령에는 거의 기록 가능한 ERG a파형 및 b파형 반응이 관찰되지 않았습니다(Fig. 2E).
6개월령 RPGR 녹아웃(KO) 마우스에서는 로돕신, M-옵신, S-옵신 발현이 유의미하게 감소한 것으로 확인되었으며, PNA 염색은 희박하게만 관찰되었으며, 이는 외세포 구조의 안정성과 단백질 안정성 저하와 일치합니다. 12개월령 RPGR KO 마우스에서는 PNA 및 S-옵신 염색이 더욱 감소하였으며, 희미한 로돕신 및 M-옵신 발현만 관찰되었습니다(Figure 3).
RPGR KO 마우스의 망막 형태학 및 기능은 천천히 진행되는 연령 관련 망막 퇴행을 보입니다. 유의미한 퇴행 변화는 6개월령부터 시작되었으며, 이는 인간에서 발생하는 진행성 망막 퇴행을 모방할 수 있음을 시사합니다. 따라서 이 RPGR 녹아웃 마우스 모델은 유전자 편집 치료 연구에 매우 우수한 동물 모델 시스템을 제공합니다.
4. RPGR 변이로 인한 망막 퇴행은 AAV-타겟 유전자 편집-Pro로 효과적으로 치료 가능
변이된 RPGR 부위를 타겟으로 하는 sGuide 분자 발현 캐스셋과 복구 도너 템플릿은 6개월령 RPGR-/yCas9+/WT 마우스에 두 개의 별도 AAV2/8 벡터를 통해 전달되었습니다(Fig. 4A-D).
5. 결론
본 논문의 연구는 명확한 아이디어를 가지고 있습니다. 먼저, 진행성 망막 퇴행의 대표적 마우스 모델을 구축하고, 표현형 검증을 거친 후, AAV를 이용하여 타겟 유전자 편집-Pro 복구 시스템을 눈에 전달하여 효과적인 치료를 수행하였습니다. 이는 안과 질환의 치료 타겟 발견을 위해서는 효과적인 질병 모델이 필요하다는 점을 보여줍니다. 현재는 마우스가 질병 모델 구축의 주요 대상으로 사용되며, 인간 게놈과의 높은 유사성, 낮은 비용, 성숙한 모델 구축 시스템 등의 요인이 이를 결정짓고 있습니다. 치료법 개발은 일반적으로 AAV를 이용하여 유전자 조각을 전달하는 방식을 사용합니다. 비록 효과적인 유전자 조각 보충 전략이 오늘날 널리 사용되고 있지만, 유전자 SNP 변이 및 기타 상황에 대한 타겟 유전자 편집-Pro 복구 전략도 지속적으로 연구 및 개발되고 있습니다.
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