AI + 미니유전자를 활용한 RNA 스플라이싱 연구의 새로운 접근법
대체 스플라이싱은 메신저 RNA 전구체(pre-mRNA) 내 다양한 스플라이싱 사이트 조합을 선택하는 조절 과정으로, 다양한 스플라이싱된 mRNA를 생성합니다. 이러한 여러 mRNA는 단일 유전자에서 유래하지만, 서열과 활성에서 차이가 있는 단백질을 코딩할 수 있습니다.
대체 스플라이싱의 조절은 다양한 상호작용 요소를 포함하며, 스플라이소좀 단백질 유전자의 특정 서열(자기작용 요소, cis-acting elements)에 영향을 받습니다. 미세한 변화(예: 단일 염기 변이)가 이상적인 대체 스플라이싱을 유도할 수 있으며, 이는 다양한 질병의 병태생리와 관련이 있습니다. 예를 들어 도셴 근이영양증(DMD)과 척수성 근위축증(SMA) 등입니다.
이번에 Cyagen은 임상 샘플 검사 과정에서 대체 스플라이싱과 관련될 수 있는 변이 부위를 검증하는 방법을 공유하고자 합니다. 과학적 검증을 수행하기 전에 이상적인 대체 스플라이싱의 가능한 병원성 부위를 신속하고 정확하게 스크리닝하는 최적의 방법을 알아보세요.
1. 이상적인 대체 스플라이싱이 발생할 수 있는 이유는 무엇인가요?
대체 스플라이싱은 스플라이싱을 조절하는 단백질과 인트론 및 엑손에 존재하는 자기작용 요소 간의 상호작용에 의해 발생합니다. 이에는 인트론 스플라이싱 증강자(ISE), 인트론 스플라이싱 억제자(ISS), 엑손 스플라이싱 증강자(ESE), 엑손 스플라이싱 억제자(ESS), Ag-엑손-GT 보존 서열이 포함됩니다. 자기작용 요소와 해당 단백질의 조합은 엑손 스플라이싱의 정확성과 효율성을 조절합니다. 또한, 조절 스플라이싱 단백질의 발현에는 공간적·시적 특이성이 존재합니다(즉, 동일한 조절 단백질이 발달 단계나 조직 부위에 따라 발현 패턴이 다릅니다). 이러한 특이성은 다양한 스플라이싱 유형의 생성에 기여할 수 있습니다.
이러한 자기작용 요소의 서열이 변이될 경우, 즉 점변이가 발생할 경우 다양한 이상적인 스플라이싱이 발생할 수 있습니다. 일반적인 이상 스플라이싱 유형에는 전체 또는 부분적 엑손 삭제, 전체 또는 부분적 인트론 보존, 다수의 엑손 삭제 등이 포함됩니다. 이상 스플라이싱의 결과로 엑손의 부분적인 서열 삭제가 발생하여, 아미노산 서열이 길게 누락된 단백질이 생성되며, 이는 3의 배수가 아닌 삽입 또는 삭제로 인해 프레임시프트 변이 또는 조기 종결 신호 생성을 유도하여 결국 정상적인 단백질 기능의 결여로 이어집니다.
2. 대체 스플라이싱은 어떻게 검증되나요?
시퀀싱을 통해 수많은 SNP 변이 부위에 접근할 수 있습니다. 일부 부위는 유전자 비암호화 영역(예: 인트론, 프로모터, 유전자 간 간격 등)에 위치하고, 일부는 인트론과 엑손 접합부 근처에 위치하여 생물정보학적 분석 대상이 될 수 있으며, 최종적으로 대체 스플라이싱과 관련된 가능성이 있는 변이 부위를 스크리닝할 수 있습니다.
기존의 생물정보학 예측 도구는 전통적인 스플라이싱 모델을 사용하여 스크리닝을 수행하지만, 대체 스플라이싱의 메커니즘은 훨씬 복잡합니다. 따라서 기존 생물정보학 예측 도구의 알고리즘은 실제 스플라이싱 상황을 정확히 시뮬레이션하지 못하며, 많은 병원성 부위를 놓치게 됩니다.
기존 생물정보학 분석과 인공지능(AI) 모델을 결합함으로써, 검증 실험에 들어가기 전에 관심 있는 변이 부위를 선별할 수 있습니다. RDDC RNA 스플라이싱 도구는 심층 신경망(DNN) 전략과 생물정보학을 기반으로 하며, 단백질 번역에 더 큰 영향을 미치는 스플라이싱 이상을 분석하여 유전 질환의 기초 변이 수준에서 원인을 규명합니다. RNA 스플라이싱 도구를 사용할 경우, 관심 유전자, 전사체 ID, 변이 부위 위치, 변이 유형만 제공하면 예측 결과를 얻을 수 있습니다.
일반적인 가설 검증 방법은 점변이 세포주를 구축하여 세포 표현형 분석과 cDNA 검출을 수행하는 것입니다. 그러나 변이 부위가 많은 경우, 점변이 세포주를 구축하는 것은 시간과 비용이 많이 소요됩니다. 미니유전자 시스템을 효과적으로 활용하면 검증 성공률이 크게 향상됩니다.
미니유전자 스플라이싱 검사에서는 변이 또는 원시형 부위를 포함하는 엑손과 인접한 인트론을 체외에서 벡터에 클로닝한 후, 해당 벡터를 세포에 전이하고 RT-PCR 및 시퀀싱을 통해 스플라이싱을 분석합니다. 일반적인 메커니즘은 연구 대상 외부 엑손과 인접한 인트론이 클로닝 부위에 삽입되며, 벡터 내 엑손 A와 B는 클로닝 부위의 상·하류에 각각 존재합니다. 이후 RT-PCR 증폭용 프라이머는 엑손 A와 B 서열을 기반으로 설계되어 검출을 위한 준비가 됩니다. 구성된 벡터를 세포에 전이한 후, 원시형 그룹은 엑손 A + 외부 엑손 + 엑손 B를 포함하는 mRNA를 발현합니다. RT-PCR과 시퀀싱을 통해 유전자형을 확인합니다. 변이 그룹이 이상적인 대체 스플라이싱을 유도할 경우, 원시형과 일치하지 않는 mRNA가 발현됩니다.
미니유전자 시스템은 이상적인 스플라이싱 연구에 널리 사용되고 있습니다. 일부 유전적 연구(그림 2 참조)에서 가족 분석 및 시퀀싱을 통해 EYS 유전자가 유전성 망막퇴행과 관련된 변이 부위를 가질 수 있음을 밝혀냈습니다. 생물정보학적 분석을 통해 두 개의 변이 부위가 대체 스플라이싱에 영향을 줄 수 있는 것으로 확인되었습니다: c.3877 + 1g > A 및 c.2992_2992+6delinsTG.
다음으로 연구자들은 미니유전자 시스템을 사용하여 예측 결과를 검증했습니다. 첫 번째 변이 부위인 c.3877 + 1g > A는 인트론 24, 엑손 25, 인트론 25를 pspl3 벡터에 삽입하고 ARPE-19 세포주에 전이한 결과, RT-PCR 증폭 및 시퀀싱을 통해 이상적인 대체 스플라이싱이 발생함을 확인했습니다(그림 3).
두 번째 변이 부위도 동일한 방법으로 검증되었습니다. 인트론 18, 엑손 19, 인트론 19를 각각 pSPL3 벡터에 삽입하고 HEK293T 및 ARPE-19 세포주에 전이한 결과, RT-PCR 증폭 및 시퀀싱을 통해 해당 부위가 이상적인 대체 스플라이싱을 유도함을 확인했습니다(그림 3).
3. 요약
이상적인 mRNA 스플라이싱은 다양한 질병의 병태생리와 밀접하게 관련되어 있습니다. 관련 약물 개발을 지원하기 위해, 그 메커니즘을 깊이 있게 탐구할 필요가 있으며, 특히 가능한 병원성 부위를 효율적이고 정확하게 스크리닝하고 효과적인 과학적 검증을 수행하는 방법이 중요합니다.
Cyagen은 강력한 생물정보학 데이터베이스를 보유하고 있으며, 인간 유전자 및 유전 질환, 동물 모델, 세포주 모델에 대해 전체 게놈 수준에서 분석이 가능합니다. 모든 가용 데이터를 기계학습 및 심층 신경망(DNN) 전문 지식과 결합함으로써, 인공지능(AI)을 활용하여 모델 선택 및 설계를 새로운 시대에 진입시키고자 합니다.
더 중요한 것은, 점변이 세포 모델 및 마우스 모델을 통해 변이 부위의 이상적인 스플라이싱 메커니즘을 실험실에서 확인할 수 있으며, 이는 ASO 치료제 개발에 유리합니다. 이 과정에서 미니유전자 시스템은 치료 효과가 있는 ASO 약물을 효율적으로 스크리닝하는 데에도 활용될 수 있습니다.
참고문헌
[1] Westin, Ida Maria 등. “EYS 변이 및 북부 스웨덴에서 EYS 관련 망막색소변성의 변이 분류를 위한 미니유전자 검사 도입.” Scientific reports, 11(1), 7696. 2021년 4월 8일.
[2] Gaildrat, Pascaline 등. “분류되지 않은 유전적 변이의 스플라이싱에 대한 영향을 평가하기 위한 스플라이싱 리포터 미니유전자 검사의 활용.” Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 653(2010), 249-257.
