B형 혈우병 질병 모델-F9 KO 마우스
이번 호에서는 B형 혈우병 모델인 F9 KO 마우스를 소개합니다. 혈우병(Hemophilia)은 유전성 응고장애(Coagulopathy)의 출혈성 질환군입니다. 공통적인 특징은 활성 트롬보플라스틴 생성 장애가 있으며 응고 시간이 길어지며 환자의 가벼운 외상 후에도 출혈 위험이 있습니다. 중증 환자의 경우에는 명백한 외상이 없어도 ‘자발성’ 출혈이 발생할 수 있습니다. 혈우병은 X 염색체와 연관된 선천성 희귀병으로 주로 남성에게 발생합니다. 전 세계적으로 약 3만 명의 남아 중 1명이 혈우병 B를 앓고 있습니다[1].
혈우병 B는 F9(FIX) 유전자 변이에 의해 발생
현재 가장 흔한 혈우병 유형은 혈우병 A와 혈우병 B에 집중되어 있으며, 혈우병 A 환자는 F8(FVIII) 유전자 변이로 인해 제8 응고 인자(Factor VIII)가 결핍되어 발생하고, 혈우병 B는 F9(FIX) 유전자 변이로 인해 제9 응고 인자(Factor IX)가 결핍되어 발생합니다. F9 유전자는 비타민K 의존적인 세린단백질가수분해효소(Serine protease, IX 인자)를 코딩합니다. 이 인자는 내인성 응고 경로에 중요한 역할을 합니다. IX 인자는 비활성 프로엔자임으로서 혈액에서 순환하며 XIa 인자에 의해 활성 펩타이드가 제거되어 활성 형태인 IXa로 전환됩니다. 응고 인자 IX는 응고 캐스케이드 반응(Cascade reaction)에서 Ca2+(칼슘) 이온, 막 인지질 및 VIII 인자와 상호 작용을 통해 인자 X를 활성화합니다(그림 1). VIII 및 IX 인자 수준이 정상 값의 50% 이상일 경우, 인체 내에서 정상적인 지혈이 가능합니다[2]. F9 유전자 결핍은 IX 인자가 부족으로 응고 장애를 일으켜 X 염색체와 연관된 열성 유전질환인 B형 혈우병을 유발할 수 있습니다.
그림 1 응고 경로 설명도[2]
혈우병 B의 중증도는 일반적으로 혈장 내 IX 인자의 활성 수준과 관련이 있습니다. 경증 혈우병 환자(IX 인자 활성 >5%, >0.05 IU/mL)는 자발성 출혈이 발생하지 않지만 외상 또는 수술 후 출혈량이 증가합니다. 중급 혈우병 환자(IX 인자 활성 1%-5%, 0.01-0.05 IU/mL)는 자발적 출혈이 드물게 발생하나 경미한 외상에도 장기간 출혈이 일어납니다. 중증 혈우병 환자(IX 인자 활성 <1%, <0.01 IU/mL)는 자발적 출혈, 유조직 또는 관절 출혈 및 심각한 피하 혈종이 발생합니다[3]. 미국 질병통제예방센터(CDC, Centers for Disease Control and Prevention)의 통계에 따르면 중증 혈우병 환자는 전체 혈우병 B 확진 환자의 30~40%를 차지합니다[4].
F9 녹아웃 모델 구축
Cyagen은 유전자 편집(CRISPER) 기술을 사용하여 마우스 F9 유전자의 1~8번 외부 엑손을 녹아웃시키고 F9 KO(제품코드: C001509) 마우스 모델을 구축했습니다. 해당 모델은 혈우병 B 관련 표현형인 응고장애를 나타내며 이는 인간 혈우병 B의 유전 메커니즘과 임상 표현형 연구에 사용될 수 있으며 치료제의 개발, 선별, 평가에 도움이 됩니다.
F9 KO 모델 검증 데이터
(1) F9 KO 마우스 F9 mRNA 발현 결핍
그림 2 F9 KO 마우스와 야생형 마우스(WT, Wild Type)의 F9 mRNA 발현량 검측
RT-qPCR 검측 결과, F9KO 마우스의 간과 담낭에서 F9mRNA의 발현이 없었고 유전자 편집(CRISPER) 모델이 성공적으로 구축되었습니다.
(2) F9 KO 마우스의 응고 4대 지표의 이상은 마우스가 응고장애를 가지고 있음을 시사
그림 3 F9 KO 마우스와 야생형 마우스(WT, Wild Type)의 응고 4대 지표
그 결과, 야생형 마우스에 비해 F9 KO 마우스의 활성화 부분 트롬포플라스틴 시간(APTT, Activated Partial Thromboplastin Time)이 현저하게 길어졌으며 마우스의 응고장애와 출혈 시간이 연장되어 전형적인 F9 KO 질병 모델의 표현형과 유사합니다[5]. 또한 F9 KO 마우스의 프로트롬빈 시간(PT, Prothrombin Time), 트롬빈 시간(TT, Thrombin Time) 및 피브리노겐(FIB, Fibrinogen) 은 야생형 마우스와 비교했을 때 큰 차이가 없었으며 임상 혈우병 B 환자 응고 지표 변화 특징과 일치합니다[6].
Cyagen 혈액 질병 관련 모델
혈우병 B 외에도, Cyagen은 혈액 질병(특히 혈액 희귀병)에 대한 유전자 편집(CRISPER) 모델을 개발했습니다. 이 모델들은 유전자 녹아웃, 유전자 녹인, 점 돌연변이 등의 유형을 포함하며 연구자의 요구에 따라 맞춤 제작 또는 협력 개발이 가능합니다.
| 표적 유전자 | 관련 질병 | 제품코드 | 제품명 |
|---|---|---|---|
| F8 | A형 혈우병 | C001211 | F8 KO |
| F9 | B형 혈우병 | C001509 | F9 KO |
| Hbb | 베타 지중해 빈혈(HBB) | C001508 | Hbb-bs&Hbb-bt DKO |
| FLvcr1 | 블랙판 다이아몬드 빈혈 | S-cKO-06994 | C578L/6J-FLvcr1em1Cflox /Cya |
| FLvcr1 | 블랙판 다이아몬드 빈혈 | S-KO-06025 | C578L/6J-FLvcr1em1C /Cya |
| Usp1 | 판코니 빈혈 | S-cKO-07336 | C578L/6J-Usp1em1Cflox /Cya |
| Usp1 | 판코니 빈혈 | S-KO-06331 | C578L/6J-Usp1em1C /Cya |
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참고 문헌:
[1]Goodeve AC. Hemophilia B: molecular pathogenesis and mutation analysis. J Thromb Haemost. 2015 Jul;13(7):1184-95.
[2]Merck Manuals Professional Edition. Hemophilia - Hematology and Oncology - MSD Manual Professional Edition. [Online] Available at: https://www.msdmanuals.com/en-in/professional/hematology-and-oncology/coagulation-disorders/hemophilia [Accessed 12 Dec. 2023].
[3]Soroka AB, Feoktistova SG, Mityaeva ON, Volchkov PY. Gene Therapy Approaches for the Treatment of Hemophilia B. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(13):10766.
[4]Centers for Disease Control and Prevention. Community Counts Registry Report – Males with Hemophilia 2014–2017. [Online] Available at: https://www.cdc.gov/ncbddd/hemophilia/communitycounts/registry-report-males/diagnosis.html
[5]Wang L, Zoppè M, Hackeng TM, Griffin JH, Lee KF, Verma IM. A factor IX-deficient mouse model for hemophilia B gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Oct 14;94(21):11563-6.
[6]Thrombosis and Hemostasis Group, Hematology Society of Chinese Medical Association; Hemophilia Treatment Center Collaborative Network of China. [Consensus of Chinese expert on the diagnosis and treatment of hemophilia (version 2017)]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2017 May 14;38(5):364-370. Chinese.
