제브라피쉬에서 신경 세포의 생년월일과 회로 통합을 시각화하는 획기적인 화학유전학 시스템 CLOK 개발

뇌의 발달과 가소성을 이해하기 위해서는 개별 신경 세포가 언제 태어나고 어떻게 기존 회로에 통합되는지를 규명하는 것이 필수적입니다. 그러나 기존의 신경생성 연구에서는 세포 고정이 필요한 브로모데옥시우리딘(BrdU)이나 에티닐데옥시우리딘(EdU)과 같은 티미딘 아날로그를 사용하는 방법이 주류였으나, 이는 생체 내 기능 분석에는 적용할 수 없었습니다. 또한, 생체 내 추적 방법도 저처리량, 제한된 시공간 분해능, 또는 침습적인 시술과 같은 과제를 안고 있었습니다. 특히, 특정 기간에 태어난 신경 세포를 식별하고 그 기능적 성숙을 실시간으로 추적할 수 있는 방법의 부재가 신경 회로 발달 메커니즘 규명의 장애물이 되었습니다.

본 연구에서는 HaloTag 기술과 다양한 형광 리간드(Janelia Fluor 염료)의 조합을 기반으로 한 'CLOK(Chromatic halotag Labeling for cell Ontogeny tracKing)'라는 새로운 화학유전학 시스템을 개발했습니다. CLOK는 제브라피쉬의 발생 과정에서 신경 세포의 생년월일을 색으로 구분하여 정확하게 매핑할 수 있게 했습니다. 특히, 시각 및 운동계에서 초기에 태어난 신경 세포와 후기 태어난 신경 세포가 서로 다른 성숙 경로를 따른다는 사실을 발견했습니다. furthermore, 이 방법은 광학 도구와 결합하여 생년월일로 정의된 신경 집단의 칼슘 및 전위 이미징, 광유전학적 조작을 가능하게 하여 행동과의 상관관계를 비침습적으로 분석할 수 있음을 입증했습니다.

CLOK 시스템의 핵심은 자기 라벨링 단백질인 HaloTag를 발현하는 신경 세포에 서로 다른 시기에 서로 다른 형광 리간드(JF 염료)를 순차적으로 투여하는 것입니다. 이를 통해 특정 시간 창 내에서 분화한 신경 세포가 특정 색소로 영구적으로 라벨링되어 생년월일이 색 코드로 기록됩니다. 본 연구에서는 제브라피쉬의 시각 중구(optic tectum)와 후뇌를 대상으로 여러 염료(JF525, JF585, JF635 등)를 동시에 사용하여 단일 개체 내에서 최대 5개의 서로 다른 연령층 신경 세포를 시각화하는 데 성공했습니다. 또한, HaloTag를 축삭 말단이나 수상돌기 등의 세포 소기관에 국소화시켜 생년월일별 세포 내 구조의 발달도 상세히 추적할 수 있습니다.

• HaloTag와 세포 투과성이 높은 JF 염료의 조합으로 높은 특이성과 안정성을 갖는 생년월일 마커 확립
• 기존 EdU법과 비교하여 비신경 세포에 대한 비특이적 염색이 적고, 더 높은 시공간 분해능(6 시간 미만) 달성
• 생체 내 장기 추적(최대 2 개월) 및 칼슘 이미징이나 광유전학 도구와의 병용을 통한 기능 분석 실현

신경 발생 이상은 자폐 스펙트럼 장애, 조현병, 간질 등 많은 신경정신 질환의 발병 기전과 관련이 있습니다. CLOK와 같은 고해상도 생년월일 매핑 기술은 특정 신경 세포 집단의 발달 지연이나 회로 통합의 이상을 식별하는 데 매우 중요합니다. 예를 들어, 특정 유전자 변이가 초기 또는 후기의 신경 세포 성숙에 어떻게 영향을 미치는지 행동 수준까지 추적함으로써, 질환 메커니즘 규명과 치료 타겟 동정이 가능해집니다. 또한, 신경 재생이나 리프로그래밍을 표적으로 하는 치료법 평가에서도 생성된 신경의 기능적 성숙을 정량적으로 평가하는 도구로 활용이 기대됩니다.

본 연구에서 사용된 HaloTag와 형광 리간드의 조합은 제브라피쉬 모델에서 매우 강력한 도구이지만, 그 원리는 다른 척추동물 모델에도 적용 가능합니다. Cyagen에서는 신경 질환 연구에 특화된 형질전환 마우스나 유전자 편집 래트 모델 제작 및 특정 유전자를 발현시키기 위한 AAV 벡터 개발 서비스를 제공합니다. CLOK와 같은 고급 이미징 기술과 결합하면 더 복잡한 포유류 모델에서의 신경 회로 발달과 기능 이상을 규명하는 전임상 연구가 가속화될 것으로 예상됩니다. 특히, 신경퇴행성 질환 모델이나 행동 분석이 필요한 모델에서 세포 수준의 생년월일 추적과 기능 평가를 통합하는 접근법이 중요해집니다.

CLOK 시스템은 신경 발생 연구의 오랜 과제였던 '생년월일 특정'과 '기능 분석'을 동시에 실현하는 획기적인 기술입니다. 투명하고 빠르게 발달하는 모델 생물인 제브라피쉬를 사용하여 신경 세포의 생년월일부터 회로 통합, 기능적 성숙까지의 전 과정을 시각화하는 데 성공했습니다. 이 기술은 신경 회로 발달 메커니즘 규명뿐만 아니라 신경 질환의 병태 이해와 신약 개발을 위한 전임상 연구에서도 필수적인 도구가 될 것입니다.