박테리오파지 유전자 필수성 매핑의 혁신: HIDEN-SEQ 기술로 밝혀낸 새로운 방어 기작

박테리오파지 (파지) 는 지구상에서 가장 풍부하고 유전적으로 다양한 생물체이며, 세균과의 공진화 과정에서 다양한 항균 방어 기전을 돌파할 능력을 갖추고 있습니다. 특히 다제내성균의 증가로 인해 파지 요법 의 임상 적용에 대한 기대가 높아지고 있지만, 파지 게놈의 대부분을 차지하는 기능 불명의 '암흑 물질 (hypothetical proteins)'이 분자 메커니즘 해명과 합리적인 응용을 가로막는 큰 장애물이 되고 있습니다. 기존의 유전자 기능 분석 방법은 모델 파지에 국한되거나 노동 집약적이어서 광범위한 파지 종에 적용하기 어려웠습니다.

본 연구에서는 파지의 유전자와 선택 가능한 표현형을 체계적으로 연결하는 트랜스포존 삽입 시퀀싱법 'HIDEN-SEQ'을 개발했습니다. 모델 파지 T4 에서 이 방법은 수년 간의 연구를 통해 확립된 필수 유전자 맵을 재현했을 뿐만 아니라, 조건에 따라 필수적인 유전자 (조건부 필수 유전자) 를 특정하는 데 성공했습니다. 구체적으로 세균의 RexAB, RnlAB, CBASS, DarTG 등의 방어 시스템에 대한 새로운 방어 인자를 동정했으며, 그 중에는 기능 주석이 없는 미지의 유전자도 포함되어 있었습니다. 또한 영양 상태 변화에 따른 필수 유전자의 변화도 검출했습니다.

HIDEN-SEQ 의 핵심은 마리너형 트랜스포존 Himar1 을 이용하여 파지 게놈에 무작위로 항 타겟 유전자 편집 유전자 (acr) 를 삽입하고, 숙주 세포 내에서 발현되는 타겟 유전자 편집-Cas13a 에 의한 선택 압력을 활용하는 점에 있습니다. 일반적으로 Cas13a 는 파지의 필수 유전자의 RNA 를 절단하여 감염을 막지만, 트랜스포존이 삽입된 파지는 acr 유전자를 발현하여 Cas13a 의 활성을 억제하고 생존 및 증식할 수 있습니다. 이 '숨겨진 Acr'을 이용한 선택 시스템을 통해 트랜스포존 삽입 부위를 포괄적으로 시퀀싱하고, 유전자 필수성을 고해상도로 매핑할 수 있습니다.

• Himar1 트랜스포존을 이용한 파지 게놈 내 무작위 삽입
• 타겟 유전자 편집-Cas13a 와 항 타겟 유전자 편집 단백질 (AcrVIA1) 을 활용한 선택적 증식
• 딥 시퀀싱을 통한 삽입 부위 정량 분석
• 모델 파지 T4, Bas37, Bas54 에의 적용 및 비교

이 연구는 파지 요법 개발에 매우 중요합니다. 임상 분리주를 이용한 스크리닝을 통해 특정 세균 숙주에서만 필수적인 유전자 (조건부 필수 유전자) 를 동정할 수 있으며, 이는 세균의 면역 방어를 회피하기 위한 핵심 인자일 가능성이 높습니다. newly 동정된 방어 인자 (예: DarTG2 에 대한 AdfM) 는 다제내성균에 대한 파지의 감염 효율을 향상시키기 위한 유전공학의 표적이 될 수 있습니다. 또한 세균의 방어 기전과 파지의 회피 전략에 대한 이해는 새로운 항균 전략 설계에도 기여합니다.

HIDEN-SEQ 은 특정 파지 종에 특화된 유전자 조작 도구로서 파지의 기능 분석 및 개량에 직접 활용될 수 있습니다. 또한 본 연구에서 동정된 필수 유전자 및 방어 인자는 타겟 유전자 편집 기술 및 유전자 편집 도구를 개발할 때 새로운 표적이나 모듈로 활용 가능합니다. Cyagen 은 유전자 기능 분석 및 질환 모델 구축을 위한 유전자 편집 마우스 와 세포주, 그리고 CRO 서비스 를 제공하여 파지와 세균의 상호작용을 규명하기 위한 전임상 연구를 지원합니다.

HIDEN-SEQ 은 박테리오파지의 '암흑 물질'을 규명하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이 방법을 통해 파지 게놈의 기능적 이해가 비약적으로 진전되며, 미생물 생태학, 바이오테크놀로지, 그리고 임상 적용에서의 파지 요법 최적화에 크게 기여할 것으로 기대됩니다.