나노포어 장쇄 RNA 시퀀싱의 변이 검출 정확도를 혁신적으로 향상시킨 딥러닝 도구 NanoTS

나노포어 장쇄 시퀀싱 기술은 풀링 (full-length) 전사체 분석과 RNA 변형 직접 검출을 가능하게 하여 RNA 연구에 혁신을 가져왔습니다. 그러나 Illumina 쇼트 리드나 PacBio HiFi 장쇄 리드에 비해 나노포어 시퀀싱의 높은 오류율은, 특히 전사체 데이터에서 정확한 변이 검출의 큰 장벽으로 남아 있습니다. 또한, 유전자 간 리드 커버리지의 불균일성, 전사 아이소폼의 다양성, 대립유전자 특이적 발현, 라이브러리 제작 기원 아티팩트 등 게놈 데이터와 다른 복잡한 요인들이 표준 장쇄 DNA 변이 검출 도구의 성능을 저하시키고 있습니다.

특히 대립유전자 불균형 (allelic imbalance) 이 존재하는 영역이나 호모폴리머 영역에서의 변이 검출은 기존 도구로는 정확도가 부족하여, 멘델 유전 질환의 원인 변이 식별을 방해하는 요인이 되었습니다. 이러한 과제를 해결하고 RNA 기반 게놈 진단의 가능성을 높이기 위한 전용 도구 개발이 시급했습니다.

본 연구에서는 나노포어 직접 RNA(dRNA) 및 cDNA 시퀀싱 데이터로부터 단일 염기 다형성 (SNP) 을 검출하기 위한 딥러닝 기반 도구 'NanoTS'를 개발했습니다. NanoTS 는 기존 방법 (Clair3-RNA, LongcallR) 을 능가하는 성능을 보여주며, dRNA 및 cDNA 데이터에서 각각 0.980 이상 및 0.966 이상의 F1 스코어를 달성했습니다. 특히 대립유전자 불균형이 두드러진 변이 검출에서 기존 도구보다 비약적으로 성능이 향상되었습니다.

또한, NanoTS 를 선천성 당단백질 결핍증 (CDG) 및 일차성 미토콘드리아 질환 (PMD) 환자 샘플에 적용한 결과, 알려진 32 개의 병인성 변이 중 30 개를 정확하게 검출 및 유전자형 판정에 성공했습니다. 이는 RNA 시퀀싱 데이터를 활용한 희귀 질환 진단에서 NanoTS 가 높은 임상적 유용성을 가짐을 시사합니다.

NanoTS 의 핵심은 대립유전자 위상화 (allele-phased) 더미업 전략과 해플로타입 정보 통합에 있습니다. 먼저 리드를 대립유전자 유형과 가닥 방향에 따라 4 개 그룹으로 분류하고, 염기 조성, 엔트로피, 커버리지, 리드 끝까지 거리, 최대 커버리지, 인접 SNP 의 염기 조성 등 6 가지 특징량을 추출합니다. 이를 통해 시퀀싱 오류와 라이브러리 아티팩트를 효과적으로 보정합니다.

• 대립유전자 위상화 전략: 초기 위상화되지 않은 모델로 고신뢰도 변이를 식별한 후, WhatsHap 을 사용하여 해플로타입으로 위상 결정을 수행하고, 위상화 모델을 통해 최종 SNP 검출을 수행하는 2 단계 접근법 채택.
• 딥러닝 아키텍처: 합성곱 신경망과 완전 연결 계층을 결합하여 추출된 특징량을 통합하고 유전자형 (0/0, 0/1, 1/1) 확률을 추정.
• 대립유전자 불균형 대응: 해플로타입 정보를 통합하여 발현량이 다른 대립유전자 간 변이 검출 정확도를 획기적으로 향상.

모델 훈련에는 GIAB 데이터베이스의 고신뢰도 변이 세트와 HG002 샘플의 나노포어 dRNA/cDNA 데이터를 사용했으며, PacBio HiFi 데이터에서도 유사한 성능 향상이 확인되었습니다.

NanoTS 의 고정밀 변이 검출 능력은 특히 유전성 질환의 원인 규명에 중요한 의미를 가집니다. 기존 쇼트 리드 시퀀싱으로는 검출이 어려웠던 스플라이싱 이상이나 발현량이 감소한 대립유전자의 변이 검출을 가능하게 합니다. 예를 들어, 본 연구에서는 PMM2 유전자의 스플라이싱 엔핸서를 파괴하는 변이와 MPV17 유전자의 크립틱 도너 부위 활성화 변이를 NanoTS 가 정확하게 동정 및 위상 결정했습니다.

이는 RNA 시퀀싱 데이터로부터 유전자 변이와 전사체 이상 (스플라이싱 이상 등) 을 동시에 분석할 수 있음을 의미하며, 유전자 치료나 올리고핵산 치료제 (ASO 등) 개발에서의 표적 검증 및 환자 분자 진단 정확도 향상에 기여할 가능성이 있습니다.

NanoTS 와 같은 고정밀 RNA 변이 검출 도구는 타겟 유전자 편집 기술을 활용한 유전자 편집 동물 모델 및 세포 모델을 이용한 전임상 연구에서, 게놈 편집 성공 여부 확인 및 변이 도입 모델의 표현형 분석에 필수적입니다. 특히, Knock-in(KI) 모델이나 점 변이 모델에서 목적 변이가 정확하게 도입되고 정상 전사체가 생성되었는지를 RNA 수준에서 검증할 때 NanoTS 는 강력한 분석 도구가 될 수 있습니다.

Cyagen 은 타겟 유전자 편집 기술을 활용한 유전자 편집 마우스 및 래트 모델 제작, 그리고 iPSC 세포주 제작 서비스를 제공합니다. NanoTS 와 병용하면 제작한 유전자 편집 모델의 변이 정확성과 전사 수준에서의 영향을 더 상세하게 평가할 수 있습니다. 또한, AAV 벡터를 이용한 유전자 치료 연구에서도 치료 후 전사체 변화를 고정밀로 모니터링하는 도구로 기대됩니다.

NanoTS 는 나노포어 장쇄 RNA 시퀀싱 데이터의 변이 검출 정확도를 극적으로 향상시키고, 대립유전자 불균형이라는 오랜 과제를 해결한 획기적인 도구입니다. 멘델 유전 질환 진단 정확도 향상뿐만 아니라, 유전자 편집 모델 검증 및 신약 개발 연구에서의 전사체 분석 품질 향상을 기대할 수 있습니다. 향후 체세포 변이 검출로의 확장도 기대되며, 생명과학 연구의 중요한 인프라로 발전할 것입니다.