벡터 설계 최적화 및 캡시드 변형은 rAAV가 응용 병목 현상을 극복하는 데 도움을 준다

재조합 아데노-연관 바이러스(recombinant Adeno-associated virus, rAAV)는 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus，AAV)를 기반으로 조작된 바이러스 벡터로 체내 또는 체외에서 외래 유전자를 효율적으로 전달할 수 있으며 유전자 치료 및 과학 연구 분야에서 널리 사용되고 있다. 1995년에 연구자들은 낭포성 섬유증 질환을 치료하기 위해 rAAV를 사용했었다. 최근 몇 년 동안 많은 rAAV 벡터 기반 유전자 치료제들이 미국 식품의약국(Food and Drug Administration，FDA)의 허가를 받았고 유전성 망막이영양증 및 척수성 근위축증 치료에 이용되고 있다. 또한 생체 내 이미징, 신경회로 표기, 유전자 녹아웃, 유전자 녹킨 및 유전자 편집 부문에서 rAAV 벡터의 적용은 대부분의 연구자들이 유전자 조작 및 기타 목적을 쉽게 달성하도록 한다.

rAAV 벡터는 성공을 거두었지만 여전히 많은 문제와 도전에 직면해 있다. 예를 들어 낮은 패키징 용량, 특정 조직 또는 세포의 표적화 불량, 일부 항원형의 낮은 생산량 등은 시급히 해결해야 할 문제이다. rAAV 벡터 설계 및 캡시드 변형을 최적화함으로써 연구자들은 위에서 언급한 어려움을 해결하는 방법을 점차적으로 찾았다. 다음은 rAAV 벡터의 적용 문제와 rAAV 벡터 설계 및 캡시드 최적화에 대한 아이디어를 소개한다.

rAAV 벡터의 적용 문제

1. 패키징 용량이 낮다

rAAV는 일반적으로 5kb 미만의 유전자 조각만 로드할 수 있으며 이 용량을 초과하면 rAAV의 독성과 활성이 크게 감소하는 경우가 많다. 그러나 유전자 치료에 사용되는 조각이나 과학 연구에서의 유전자 길이에 관계없이 전달되는 많은 유전자 조각은 크기가 5kb보다 크므로 적용을 크게 제한한다.

2. 체내에 미리 저장된 면역은 rAAV의 유효성을 저하시킨다

기존 과학 연구에 따르면 인구의 40~80%가 rAAV에 대한 중화 항체를 가지고 있음을 입증했다. 표적 세포를 감염시키는 rAAV의 효율은 체내에 이미 존재하는 면역 중화 항체의 존재로 인해 제한된다. 따라서 표적 조각의 발현에 영향을 미친다.

3. 조직 표적화가 좋지 않다

일부 rAAV 항원형은 특정 세포 또는 조직에 대해 덜 표적화되거나 적절한 항원형이 없다. rAAV의 흡착, 침입, 세포내 수송, 프로테아좀 분해, 핵 진입, 캡시드 해제 등 단계들은 모두 캡시드 단백질의 구조와 관련이 있기 때문에 캡시드 단백질의 구조는 rAAV 표적 특이성에 영향을 미치는 중요한 요소이다.

4. 형질도입 능력이 낮고 안전위험이 높다

일부 rAAV 항원형은 형질도입 능력이 낮고 표적 유전자의 전달을 위해 높은 용량이 필요한 경우가 많다. 그러나 치료 유전자가 간에 축적되어 간독성을 유발할 수 있다. rAAV의 형질도입 능력은 캡시드 단백질과 밀접한 관계를 가지고 있다.

5. 생산량이 적고 생산 비용이 높다

유전자 치료제로서 rAAV의 역가는 더 높아야 한다. 전신 약물 투여를 위해서는 고용량 투여도 필요하다. 그러나 rAAV의 생산량은 적고 항원형에 따라 생산량은 상이하다. 이는 유전자 치료 분야에서 rAAV를 적용하는 데 어려운 점이기도 하다. 이전 연구에 따르면 캡시드 단백질은 rAAV 생산량에 큰 영향을 미친다.

rAAV 벡터 설계 및 캡시드 변형 최적화

1. rAAV 벡터 설계 최적화

rAAV 벡터 설계를 최적화함으로써 rAAV의 로딩 용량을 어느 정도 확장하고 표적화를 개선하며 면역원성을 줄일 수 있다. 너무 긴 유전자 조각의 경우 rAAV 게놈을 사용하여 ITR 서열 또는 중복 서열 간의 상동 재조합을 통해 연쇄체로 연결할 수 있으며 표적 조각을 여러 개의 작은 조각으로 분할하고 두 개 이상의 rAAV 바이러스로 패키징하여 전달 조각의 길이를 확장할 수 있다.

특정 프로모터는 특정 조직 및 세포 유형에서 표적 유전자의 발현을 가능하게 할 수 있지만, 일반적으로 특정 프로모터의 활성은 CMV와 같은 광범위한 바이러스 프로모터보다 낮다. 특정 프로모터를 인핸서 서열과 결합하면 특정 프로모터의 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, hAAT 프로모터를 기반으로 간 특이적 인핸서 ApoE를 결합하면 간에서 표적 유전자의 발현 수준을 효과적으로 증가시킬 수 있다. 또한 프로모터의 길이를 짧게 하여 표적 유전자의 로딩 용량을 확장시킬 수 있다.

rAAV 게놈의 3'UTR 영역에 조직 특이적으로 발현되는 miRNA의 인식 부위를 도입함으로써 표적 유전자의 표적 이탈 위험을 효과적으로 줄이고 면역원성을 감소시킬 수도 있다. 예를 들어, miRNA122a 결합 부위의 간 특이적인 발현의 도입은 간에서 표적 유전자의 발현을 효과적으로 감소시킬 수 있다.

2. rAAV 캡시드 변형 최적화

캡시드 단백질은 rAAV의 형질도입 능력, 표적화, 면역원성 및 생산량에 중요한 영향을 미치므로 연구자들은 rAAV의 캡시드 단백질 변형을 최적화하여 rAAV의 적용성을 개선하기를 바란다. 오늘날 rAAV 캡시드의 변형 최적화에는 자연적 발견, 합리적 설계, 유도 진화 및 컴퓨터 지원 유도 진화라는 4가지 전략이 있다.

그림 1 신규 rAAV 항원형을 얻기 위한 주요 방법[6]

일반적으로 사용되는 rAAV 항원형은 대부분 자연적으로 발견되지만 종류가 적어 오늘날의 연구 요구를 충족시키기 어렵다. 따라서 많은 연구자들이 비인간 영장류에서 새로운 rAAV 항원형을 분리했다. 그러나 자연적인 발견의 방법을 통해서도 rAAV의 종류는 여전히 적고 전자의 적용에 문제가 있으므로 여전히 추가적인 변형 최적화가 필요하다.

일반적으로 사용되는 rAAV 항원형의 경우 캡시드의 구조, 감염 과정, 체내 대사 등을 분석한 후 합리적으로 설계된 전략을 통해 캡시드를 변형하여 rAAV 형질도입률과 표적 특이성을 향상시킬 수 있다. 일반적으로 사용되는 방법은 캡시드 단백질의 특정 위치에서 삽입하고 돌연변이시키는 것이다. rAAV 캡시드의 특정 부위에 폴리펩티드 서열이 삽입되며 삽입된 폴리펩티드 서열은 rAAV 패키징 및 형질감염에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 특정 세포 유형의 표면 항원을 특이적으로 인식하여 rAAV의 표적 특이성을 향상시킨다. 예를 들어, rAAV2의 587번째 부위에 내피 세포를 표적으로 하는 폴리펩티드 서열을 삽입 및 발현하면 내피 세포에 대한 rAAV2의 표적화 능력을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 또한 부위 지정 돌연변이를 통해 캡시드 단백질의 구조를 개선하고 rAAV의 기능도 최적화할 수 있다. 예를 들어, rAAV2의 캡시드에서 여러 부위를 돌연변이시키고 효과적인 돌연변이를 스크리닝한 결과 다중 돌연변이 rAAV2의 기능이 최적화되었음을 발견했다. 돌연변이 rAAV2를 인식하고 중화시키는 면역 중화 항체의 능력이 크게 감소한다는 점에서 주로 나타난다. rAAV의 기능은 합리적인 설계 전략을 통해 효과적으로 최적화할 수 있지만 이 전략은 연구자의 설계 경험에 의존하며 성공 확률이 낮고 제한된 rAAV 캡시드 변이체만 찾을 수 있다는 큰 단점들이 있다.

유도 진화 전략은 합리적인 설계 전략이 직면한 병목 현상을 잘 해결할 수 있다. 유도 진화는 rAAV의 작용 메커니즘, 캡시드 구조 등의 배경을 알 필요가 없으며 무작위 돌연변이, 체외 재조합 등의 방법을 통해 풍부한 유전자 돌연변이 라이브러리를 구축한 다음 실제 필요에 따라 라이브러리에 스크리닝 압력을 가하고 반복 스크리닝을 거쳐 새형의 표적 rAAV 변이체를 수집한다. 유도 진화 전략을 적용하여 더 많은 rAAV 항원형이 스크리닝되었다. 예를 들어 Tervo 등은 뉴런의 축삭을 따라 역방향으로 수송될 수 있는 돌연변이 지도 rAAV2-retro를 획득했다. 유도 진화는 다양한 항원형을 스크리닝할 수 있지만 이 전략은 높은 기술적 한계, 긴 주기, 높은 비용으로 인해 항원형 변형을 어느 정도 제한한다.

유도 진화가 직면한 병목 현상의 경우 '컴퓨터 지원 유도 진화'는 좋은 아이디어이자 솔루션이다. 특히 인공지능을 이용한 rAAV 캡시드 단백질 설계 방법은 높은 처리량, 낮은 비용, 짧은 주기라는 장점이 있다. 일반적인 과정은 큰 rAAV 벡터 라이브러리를 구축하고 바이러스로 패키징하여 생체 및 시험관 실험을 거쳐 데이터를 얻는 것이다. 데이터는 AI 모델을 훈련하고 최적화하는 데 사용된다. 그런 다음 실제 요구 사항(높은 역가, 특정 표적, 낮은 면역원성 등)에 따라 AI 모델을 사용하여 알맞는 새로운 항원형을 예측한다. 그리고 생체 및 시험관 실험 검증을 거쳐 신규 항원형의 유효성을 판단한다. AI 예측 모델은 캡시드 단백질의 유도 진화와 합리적인 설계에 참조를 제공하여 rAAV 변형 최적화의 성공률을 크게 향상시킬 수 있다.

그림 2. AI 기반의 효율적인 rAAV 캡시드 단백질 최적화 프로세스

요약

rAAV는 유전자 치료 및 과학 연구 분야에서 광범위한 응용 전망을 가지고 있지만 표적화 불량, 낮은 형질도입 능력 및 체내 면역 사전 저장과 같은 문제들에 직면해 있다. 벡터 설계를 최적화하면 어느 정도 해결할 수 있지만 신규 항원형의 개발은 이러한 병목 현상을 근본적으로 극복할 수 있게 한다. 신규 항원형을 포괄적으로, 효과적으로, 신속하게, 그리고 저비용으로 개발하기 위해 AI를 이용한 유도 진화 전략이 좋은 아이디어를 제공한다. 가까운 미래에 신규 rAAV가 더 많이 발견되어 많은 연구자들의 연구를 촉진시키고 유전자 질환 환자들에게 도움을 줄 것이다.

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