Calca 녹아웃 마우스 소개

Calca 유전자

이 유전자는 RNA의 대체 스플라이싱 및 유전자 전사체의 비활성 전구체 단백질 절단을 통해 펩티드 호르몬 칼시토닌, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 및 카타칼신을 코드화합니다. 칼시토닌은 칼슘 조절에 관여하면 인 대사를 조절하는 기능을 합니다. 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 혈관 확장 및 항균 펩타이드의 기능이 있으며, 카타칼신은 칼시토닌 펩타이드의 일종입니다.

CGRP는 중추 및 말초 신경계에서 폭넓게 발현되며 말초 혈관 확장, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR) 합성, 고환 하강, 통증 지각, 탄수화물 대사, 위장 운동성, 신경성 염증 및 위산 분비를 비롯한 다양한 생리 활동에 관여합니다.

그림 1. CALCA 유전자는 조직 특이적 방식으로 칼시토닌과 α-칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)를 생성^[1]

Calca 녹아웃 마우스 표현형

Hoff 등은 상동 재조합 방식으로 Neo를 사용하여 Calca 유전자의 엑손 2-5를 대체하여 유전자 결실의 목적을 달성했습니다.^[2]

그림 2. Calca 유전자가 결실된 마우스 육성하기^[2]

1 칼슘 대사

동형접합 Calca 녹아웃(KO) 및 야생형(WT) 마우스, 혈청 칼슘, 이온화 칼슘, 인, 무결한 부갑상선 호르몬(PTH), 티록신 및 1,25-디하이드록시비타민 D3(1,25-D3) 사이에 차이가 없습니다.

표 1. 암컷 쥐 칼슘 대사 인자의 기저 생화학적 분석^[2]

hPTH(인간 부갑상선 호르몬, 0.5㎍/g 체중)로 KO 및 WT 마우스를 처리했습니다. KO 마우스는 hPTH 주사 2시간 및 4시간 후 혈청 칼슘 및 소변 데옥시피리디놀린(DPD) 농도의 유의한 증가를 보였으며, WT 마우스는 큰 변화가 없었습니다(그림 3a). 실험 중에 혈청 칼시토닌(CT)의 병렬 측정에서는 WT 마우스의 혈청 CT가 유의하게 증가하는 반면, KO 마우스의 혈청 CT는 증가하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 3b). 이에 대한 한 가지 합리적인 설명은 PTH로 처리된 WT 마우스에서 혈청 CT의 증가가 파골세포 매개 골 흡수 및 혈청 칼슘 수준의 후속적인 증가를 방지했다는 것입니다. hPTH 주사 직전에 10~100pg/g의 용량으로 CT 전처리를 수행하면 PTH 매개 혈청 칼슘 농도의 증가를 억제할 수 있으므로(그림 3c), 고칼슘혈증을 예방할 수 있습니다.

그림 3. 부갑상선 호르몬 자극 골 흡수가 KO 마우스에서 고칼슘혈증을 유발하고 CT 투여에 의해 차단됨^[2]

2 뼈의 X선 촬영 및 조직형태 측정

척추체와 경골의 X선 촬영 결과, 1개월 및 3개월령 암컷 KO 마우스의 골밀도가 같은 연령의 암컷 WT 마우스보다 골밀도가 높았습니다. 조직학적 분석에 따르면 암컷 KO 마우스의 척추골 부피는 1개월 및 3개월 이내에 유의하게 증가했으며, 근위 경골 섬유주의 부피는 3개월 이내에 유의하게 증가했습니다(그림 4a). 조직 형태학적 분석에서는 KO 암컷 마우스의 골 부피와 소주골 수의 유의한 증가가 확인되었습니다(그림 4b). WT 및 KO 마우스의 섬유주 두께는 동일했으나 KO 마우스의 섬유주 간격은 현저히 감소했습니다.

그림 4. Calca 유전자 KO로 생쥐 뼈 증가^[2]

3 감염 모델

13년 간의 연구에서 Calca 녹아웃 마우스(KO)와 WT 마우스는 폐렴연쇄구균 또는 슈도모나스 에루지노사에 감염되었습니다. 적정 농도를 사용하면 WT 마우스의 20-80%가 사망했으므로, WT 마우스에 비해 KO의 생존이 증가하거나 감소하는 것을 파악할 수 있었습니다. 폐렴연쇄구균에 감염된 KO 마우스는 대부분 3일째에 사망하였으며, 슈도모나스 에루지노사에 감염된 마우스는 대부분 2일째에 사망하고 일부는 4일째에 사망하였으며, 전체 생존 기간은 7일이었습니다. 그람 양성(폐렴연쇄구균) 감염에서 WT 마우스의 7일 생존율은 3/13(23%)이었고 KO 마우스의 7일 생존율은 3/14(21.4%)였습니다. 그람 음성(슈도모나스 에루지노사) 감염에서 WT 마우스의 7일 생존율은 2/10(20%)이었고 KO 마우스의 7일 생존율은 2/11(18.2%)였습니다. 그람 양성 또는 그람 음성 폐렴 감염에서 WT 마우스와 KO 마우스의 생존율 사이에 큰 차이는 없었습니다.

그림 5. 폐렴 감염에 대한 야생형(WT) 및 Calca 녹아웃(KO) 마우스의 반응^[3]

폐렴연쇄구균 감염 24시간 후 WT 마우스에서 혈청 칼시토닌/프로칼시토닌(CT/PCT) 면역 반응이 2.1배 증가했지만 KO 마우스에서는 검출되지 않았습니다. 이 연구에서는 또한 CT의 표준 방사선 면역 측정법을 사용하여 다음과 같은 시료를 분석했습니다. WT 마우스는 기준선에서 부갑상선 호르몬 자극 후 혈청 CT/PCT 면역 반응성이 4.4배 증가하고 폐렴연쇄구균 감염 24시간 후에는 2.6배 증가하는 것을 검출할 수 있었지만, KO 마우스는 이러한 조건에서 혈청 CT/PCT 면역 반응이 검출되지 않았습니다.

그림 6. 폐렴 감염에 대한 야생형(WT) 및 Calca 녹아웃(KO) 마우스의 반응^[3]

상기 데이터는, KO 마우스가 감염 및 염증 기간 동안 비내분비 PCT의 낮은 발현으로 인해 패혈증의 발병기전에서 PCT의 기능을 테스트하는 데에는 이상적인 기능 상실 모델이 아니라는 것을 보여줍니다.

연구에 따르면, Calca 유전자는 생식에 있어 필수가 아니고 이 유전자의 손실은 심각한 발달 결함과 관련이 없으며, 기본 칼슘 또는 기타 미네랄 항상성에 영향을 미치지 않는 것으로 보입니다. 그러나, 세밀히 관찰하면 정상적인 뼈와 미네랄 항상성에서 CT의 기능을 확인할 수 있습니다. 결함이 있는 마우스는 외인성 PTH 투여에 더 민감했습니다. 후속 분석에서 파골세포 또는 골 흡수 마커(DPD)의 수치에는 차이가 없는 반면, 골 형성 속도는 현저히 증가하는 것으로 나타났습니다. KO 마우스에서 예상치 못한 골 형성 증가 발현은 골 형성 조절에 있어 Calca 유전자 산물이 관여하는 기능이 알려져 있지 않다는 것을 나타냅니다. 골 재생 장애는 많은 골절 환자에 영향을 미친다는 점을 고려할 때, 메카니즘적인 수준에서 골절 치유를 이해하고 골 재생에 주로 영향을 미치는 매개체를 파악하는 것은 임상적, 과학적으로 매우 중요합니다. CGRP 수용체가 세포 표면과 결합하여 탁월한 약물 표적이 된다는 점을 감안하면, 선택적 CGRP 작용제는 손상된 골절 치유의 치료를 위한 잠재적인 약리학적 방법론으로 증명될 가능성이 있습니다.^[4]