FD에서 인트론 변이를 모델링하기 위한 인간화 ELP1 마우스의 개발
전장 유전체 시퀀싱의 발전과 함께 인트론 돌연변이가 다양한 질환, 특히 희귀 질환에 중요한 역할을 한다는 인식이 높아지고 있습니다. 정상적인 유전자 전사 과정에서 엑손과 인트론 모두 전구 메신저 RNA(pre-mRNA)로 복제된 후, 스플라이싱 과정이 인트론을 제거하여 최종적으로 단백질로 번역되는 코딩 서열을 생성합니다. 연구에 따르면 질병 관련 유전자 돌연변이 중 약 10%-30%(주로 인트론 돌연변이) 이 스플라이싱에 영향을 주거나 인핸서나 실렌서와 같은 조절 요소를 방해하여, 암호화 스플라이스 부위 활성화, 위 엑손 포함, 엑손 스킵핑과 같은 기전을 유발하여 궁극적으로 질병 병리를 초래할 수 있습니다. 이러한 기전은 종종 조기 종결 코돈 (PTC) 을 생성하여 무의미 매개 RNA 분해 (NMD) 를 유발하거나, 단백질 이차 구조의 변화, 또는 유전자/단백질 발현 수준의 조절 이상을 초래합니다. [1-3] 오늘 Cyagen 은 인트론 돌연변이로 인한 질병의 대표적인 사례인 가족성 자율신경실조증 (Familial Dysautonomia) 의 인간화 유전자 연구 모델을 논의합니다.
Familial Dysautonomia (FD) 및 ELP 유전자 인트론 돌연변이
Familial Dysautonomia (FD) 는 신경 발달 장애 및 중추 신경계 퇴행으로 인해 발생하는 희귀 유전성 신경 질환입니다. 자율신경계 및 감각신경계의 결함으로 인해 환자는 과도한 발한, 간헐적 고혈압, 침 분비, 삼키기 곤란, 불규칙한 장 및 방광 조절, 호흡 곤란 및 주기적인 구토와 같은 증상을 보입니다. 이 질환은 특정 인종 및 조상 그룹과 관련이 있으며, 주로 아슈케나지 유대인을 대상으로 하며, 이 집단에서의 발병률은 약 3,600 명 중 1 명입니다. 환자의 약 50% 만 40 세까지 생존합니다. [4-5]
ELP1 (IKBKAP) 유전자는 뉴런의 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 엘롱가타 복합체의 구성 요소를 암호화합니다. 거의 모든 FD 환자는 ELP1 유전자의 대립 유전자 돌연변이를 가지고 있으며, 그중 99% 이상은 인트론 20 의 5' 스플라이스 부위 (IVS20+6T>C) 에서의 돌연변이를 포함합니다. 이 돌연변이는 U1 소형 핵 리보핵단백질 (snRNP) 과 인트론 20 의 기증자 스플라이스 부위 사이의 염기 짝짓기를 방해하여 엑손 20 스킵핑을 유발합니다. [4-6] 이러한 잘못된 스플라이싱은 전사체 읽기 프레임의 프레임 시프트를 일으켜 조기 종결 코돈 (PTC) 을 생성하며, 이는 절단된 ELP 단백질로 번역되어 궁극적으로 신경 손상 및 세포 사멸을 초래합니다.
Familial Dysautonomia: 타겟 ELP1 치료제 및 관련 동물 모델
현재 FD 에 대한 완치법은 없으며, 치료 전략은 주로 증상 완화 및 지지 치료를 통해 증상을 완화하고 합병증을 예방하는 데 중점을 둡니다. IVS20+6T>C 돌연변이가 FD 에서 가장 흔한 병인 돌연변이이므로, 연구는 이 돌연변이로 인한 스플라이싱 오류를 수정하여 풀 길이 ELP1 단백질을 생성하는 데 집중해 왔습니다. 콜드 스프링 하버 연구소와 PTC Therapeutics 의 연구자들은 이 분야에서 중요한 연구를 수행했으며, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (ASO) 및 소분자 약물 개발을 포함합니다. [7-9]
연구에 따르면 ELP1 유전자의 인트론 돌연변이 스플라이싱 패턴을 조사하기 위해 야생형 마우스 (wt 마우스) 를 사용하는 것은 효과적이지 않습니다. 동형 접합 Elp1 녹아웃 (Knockout) 마우스는 배아 발달 중에 사망하기 때문입니다. 인간 돌연변이 ELP1 유전자를 발현하는 형질전환 마우스는 정상적인 내인성 마우스 Elp1 유전자 발현 수준으로 인해 명확한 질병 표현형을 보이지 않습니다. 이는 마우스의 내인성 Elp1 유전자의 Elp1 유전자 녹다운 (단일 복사 녹아웃) 과 형질전환 유전자의 결합을 필요로 합니다. 그러나 이 접근 방식은 불안정한 형질전환 복사본 및 일관되지 않은 표현형과 같은 문제를 여전히 안고 있습니다. [10-12] 또한, 마우스와 인간 간의 스플라이싱 패턴 차이로 인해 마우스 Elp1 유전자의 엑손 20 을 인간화하여 IVS20+6T>C 돌연변이 및 인접 인트론을 도입하는 시도는 표현형을 생성하는 데 실패했습니다. [13]
이러한 연구들은 마우스에서 ELP1 유전자의 스플라이싱 패턴을 조사하려면 더 길거나 심지어 풀 길이의 인간 ELP1 유전자 서열이 필요할 수 있음을 시사합니다.
B6-hELP1 마우스 모델: FD 연구를 위한 새로운 도구
효과적인 FD 연구의 필요성을 충족하기 위해 Cyagen 은 B6-hELP1 인간화 마우스 모델 (제품 번호: I001203) 을 개발했습니다. 이 모델에서는 마우스 Elp1 유전자의 시작 코돈에서 정지 코돈까지의 서열이 해당 인간 ELP1 유전자 서열로 자리 대체 (in situ) 되었습니다. 또한, 이 모델을 기반으로 Cyagen 은 현재 연구자들의 FD 연구를 지원하기 위해 IVS20+6T>C 인간화 FD 질환 점 돌연변이 모델을 개발 중입니다.
B6-hELP1 마우스가 인간 ELP1 유전자를 성공적으로 발현합니다
발현 분석 결과, B6-hELP1 마우스의 대뇌 피질, 신장, 간, 골격근 및 심장을 포함한 다양한 조직에서 인간 ELP1 유전자의 상당한 발현 수준이 관찰되었으며, 마우스 유래 Elp1 유전자 mRNA 는 검출되지 않았습니다.
요약
FD 치료에 대한 현재 연구는 주로 돌연변이로 인한 스플라이싱 오류를 수정하여 풀 길이 ELP1 단백질을 생성하는 데 중점을 두고 있습니다. B6-hELP1 모델 (제품 번호: I001203) 은 내인성 마우스 Elp1 유전자의 간섭 없이 마우스에서 풀 길이 인간 ELP1 유전자를 발현하므로 FD 연구를 위한 귀중한 도구입니다. 예비 연구에 따르면, B6-hELP1 IVS20+6T>C 인간화 점 돌연변이 모델 (개발 중) 은 인간 FD 환자에서 관찰되는 것과 유사한 표현형을 보일 것으로 예상됩니다.
B6-hELP1 모델 외에도 Cyagen 은 신경계, 안과 및 기타 질환을 위한 다양한 유전적 인간화 모델을 개발하여 연구자들이 다양한 질환에 대한 표적 치료법을 개발하는 데 강력한 지원을 제공하고 있습니다.
풀 길이 게놈 서열 인간화 HUGO 마우스 모델
| 제품 번호 | 제품 | 계통 배경 | 응용 분야 |
|---|---|---|---|
| C001396 | B6J-hRHO | C57BL/6JCya | 망막색소변성증 (RP), 선천성 고정 야맹증 (CSNB) 및 기타 망막 질환. |
| C001410 | B6-htau | C57BL/6JCya | 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경퇴행성 질환. |
| C001418 | B6-hTARDBP | C57BL/6JCya | 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD) 및 기타 신경퇴행성 질환. |
| C001427 | B6-hSNCA | C57BL/6NCya | 파킨슨 병 (PD). |
| C001437 | B6-hIGHMBP2 | C57BL/6NCya | 호흡 곤란 동반 척수성 근위축증 1 형 (SMARD1) 및 Charcot-Marie-Tooth 질환 2S 형 (CMT2S). |
| C001495 | B6-hRHO-P23H | C57BL/6JCya | 망막색소변성증 (RP), 선천성 고정 야맹증 (CSNB) 및 기타 망막 질환 연구 |
| C001504 | B6-hSMN2(SMA) | C57BL/6NCya | 척수성 근위축증 (SMA) |
| I001128 | B6-hMECP2 | C57BL/6NCya | 레트 증후군 (RTT) |
| I001124 | B6-hLMNA | C57BL/6NCya | 허친슨 - 길포드 프로게리아 증후군 (HGPS) |
| C001398 | B6-hATXN3 | C57BL/6NCya | 척수 소뇌 실조증 3 형 (SCA3) |
| C001512 | B6-hTTR | C57BL/6NCya | 트랜스티레틴 아밀로이드증 (ATTR) |
| I001131 | B6-hSCN2A | C57BL/6NCya | 간질 |
| I001132 | B6-hCFTR | C57BL/6NCya | 낭포성 섬유증 (CF) |
| C001525 | H11-Alb-hTTR*V50M | C57BL/6NCya | 트랜스티레틴 아밀로이드증 (ATTR) |
| I001130 | B6-hATP7B | C57BL/6NCya | 간뇌 변성증 (HLD) |
| IR1019 | SD-hGFAP Rat | Sprague-Dawley | 알렉산더 병 (AxD), 외상성 뇌 손상 |
| C001533 | B6-hINHBE | C57BL/6NCya | 비만, 지방 분포 및 저장의 이상과 관련된 대사 장애 |
| C001538 | B6-hCOL7A1*c.6527dupC | C57BL/6NCya | 이영양성 표피박리증 (DEB) |
| C001428 | B6-hCOL7A1 | C57BL/6NCya | 표피박리증 (EB) |
| C001546 | B6-hTGFBI | C57BL/6JCya | 각막 이영양증 (CD) |
| C001551 | B6-hABCA4 | C57BL/6JCya | 스타가르트 질환 (STGD) |
| C001554 | B6-hUSH2A(E10-15) | C57BL/6JCya | 어셔 증후군 (USH) |
| C001555 | B6-hVEGFA | C57BL/6JCya | 황반변성 (AMD); 당뇨병성 망막증 (DR); 각막 신생혈관; 종양 발생 및 발달 기전 및 항종양 약물 개발. |
| I001191 | B6-hFUS | C57BL/6JCya | 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전두측두엽 변성/치매 (FTLD) |
| I001181 | B6-htau*P301L | C57BL/6JCya | 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경퇴행성 질환. |
| I001182 | B6-htau*P301S | C57BL/6JCya | 전두측두엽 치매 (FTD), 알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경퇴행성 질환. |
참고 문헌
[1] Jaganathan K, Kyriazopoulou Panagiotopoulou S, McRae JF, Darbandi SF, Knowles D, Li YI, Kosmicki JA, Arbelaez J, Cui W, Schwartz GB, Chow ED, Kanterakis E, Gao H, Kia A, Batzoglou S, Sanders SJ, Farh KK. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning. Cell. 2019 Jan 24;176(3):535-548.e24.
[2] Chiang HL, Chen YT, Su JY, Lin HN, Yu CA, Hung YJ, Wang YL, Huang YT, Lin CL. Mechanism and modeling of human disease-associated near-exon intronic variants that perturb RNA splicing. Nat Struct Mol Biol. 2022 Nov;29(11):1043-1055.
[3] Lord J, Baralle D. Splicing in the Diagnosis of Rare Disease: Advances and Challenges. Front Genet. 2021 Jul 1;12:689892.
[4] Rubin BY, Anderson SL. IKBKAP/ELP1 gene mutations: mechanisms of familial dysautonomia and gene-targeting therapies. Appl Clin Genet. 2017 Dec 15;10:95-103.
[5] Dietrich P, Dragatsis I. Familial Dysautonomia: Mechanisms and Models. Genet Mol Biol. 2016 Oct-Dec;39(4):497-514. doi: 10.1590/1678-4685-GMB-2015-0335. Epub 2016 Aug 4.
[6] Rubin BY, Anderson SL. The molecular basis of familial dysautonomia: overview, new discoveries and implications for directed therapies. Neuromolecular Med. 2008;10(3):148-56.
[7] Morini E, Gao D, Montgomery CM, Salani M, Mazzasette C, Krussig TA, Swain B, Dietrich P, Narasimhan J, Gabbeta V, Dakka A, Hedrick J, Zhao X, Weetall M, Naryshkin NA, Wojtkiewicz GG, Ko CP, Talkowski ME, Dragatsis I, Slaugenhaupt SA. ELP1 Splicing Correction Reverses Proprioceptive Sensory Loss in Familial Dysautonomia. Am J Hum Genet. 2019 Apr 4;104(4):638-650.
[8] Sinha R, Kim YJ, Nomakuchi T, Sahashi K, Hua Y, Rigo F, Bennett CF, Krainer AR. Antisense oligonucleotides correct the familial dysautonomia splicing defect in IKBKAP transgenic mice. Nucleic Acids Res. 2018 Jun 1;46(10):4833-4844.
[9] Ajiro M, Awaya T, Kim YJ, Iida K, Denawa M, Tanaka N, Kurosawa R, Matsushima S, Shibata S, Sakamoto T, Studer L, Krainer AR, Hagiwara M. Therapeutic manipulation of IKBKAP mis-splicing with a small molecule to cure familial dysautonomia. Nat Commun. 2021 Jul 23;12(1):4507.
[10] Dietrich P, Yue J, E S, Dragatsis I. Deletion of exon 20 of the Familial Dysautonomia gene Ikbkap in mice causes developmental delay, cardiovascular defects, and early embryonic lethality. PLoS One. 2011;6(10):e27015.
[11] Hims MM, Shetty RS, Pickel J, Mull J, Leyne M, Liu L, Gusella JF, Slaugenhaupt SA. A humanized IKBKAP transgenic mouse models a tissue-specific human splicing defect. Genomics. 2007 Sep;90(3):389-96.
[12] Morini E, Dietrich P, Salani M, Downs HM, Wojtkiewicz GR, Alli S, Brenner A, Nilbratt M, LeClair JW, Oaklander AL, Slaugenhaupt SA, Dragatsis I. Sensory and autonomic deficits in a new humanized mouse model of familial dysautonomia. Hum Mol Genet. 2016 Mar 15;25(6):1116-28.
[13] Bochner R, Ziv Y, Zeevi D, Donyo M, Abraham L, Ashery-Padan R, Ast G. Phosphatidylserine increases IKBKAP levels in a humanized knock-in IKBKAP mouse model. Hum Mol Genet. 2013 Jul 15;22(14):2785-94.
